基础类似于图2所示，但在该系统中两个末端引物具有高于系统环境温度 的熔解温度，因此不会扩增，除非该系统的限制因素被满足。
[0122] 上游引物与IO重叠，下游引物与DE重叠，因此与该元件部分同源。
[0123] 该系统的所有单链元件变成被单链结合蛋白GP32包被，尽管这不是DE必需的。作 为UVSX辅因子的UVSY也包被10。GP32包被的元件具有减弱的分枝迀移能力。UVSX只包 被10,因为只有这个元件包括足以诱导所述过程的长度。
[0124] 3Β :重组酶包被的IO插入双链熔解上游末端。下游末端是不熔解的，因为其Tm 高于环境温度，还因为UVSX在该区域聚合将双链夹紧在一起。上游引物结合但不立即延 伸，因为其3'区与IO重叠，必需首先分枝迀移。它与栓系的突出模板链（其在结合方面胜 过引物）竞争，系统仍然是无效的。还有可能在重组酶去聚合后栓系的下游末端向后分枝 迀移闭合初始双链，但不管怎样，系统不会充分扩增。
[0125] 3C : DE分枝迀移入下游双链，因为剩余下游双链的Tm低于环境温度，它被分离。 UVSX去聚合，因为上游末端结合引物，双链被完全分离。
[0126] 3D :这使得下游引物结合并延伸，还给予上游引物分枝迀移并延伸产生两个拷贝 的双链的机会。
[0127] 值得注意地，任何引物假象需要包括DE的结合序列。因为DE由不是聚合酶底物 的元件组成，所以这不会发生。
[0128] 图4显示一种利用反向互补寡核苷酸的扩增方法，这样的话不会形成非特异性产 物。
[0129] 4A :该系统的元件如I-IV所示。双链模板如虚线所示。I代表上游引物；II代 表在其3'末端具有非同源碱基的插入寡核苷酸；III代表在其3'末端与非同源碱基的反 向互补序列和IV代表下游引物。
[0130] 在该系统中，两个末端引物具有高于系统的临界熔解温度的长度，因此不会形成 非特异性假象，除非非特异性假象与靶模板相同。
[0131] 上游引物与IO在相同方向重叠。下游引物不与IO重叠，但与附加的元件RC重叠。 RC既不是聚合酶底物也不是重组酶底物，与下游引物和IO重叠。这样的话，下游引物包括 具有与RC的5'区相同的序列的3'末端。RC包括与下游引物类似的5'序列以及与IO互 补的3'序列。
[0132] 除了 DE之外的该系统所有单链元件被GP32包被。作为UVSX辅因子的UVSY也包 被这些元件。包被的元件具有减弱的分枝迀移能力。UVSX只有效包被10,因为只有这个元 件包括足以诱导所述过程的长度。
[0133] 4B :重组酶包被的IO插入双链熔解上游末端，因为它低于临界温度。下游末端 是不熔解的，因为它高于临界温度，还因为UVSX在该区域聚合将双链夹紧在一起。上游引 物结合但不立即延伸，因为其3'区与IO重叠，必需首先分枝迀移。它与栓系的突出模板链 (其在结合方面胜过引物）竞争，系统仍然是无效的。
[0134] 4C : UVSX去聚合，但双链保持部分熔解。这使得RC结合10,然后分枝迀移入下 游双链。
[0135] 4D :因为剩余双链低于临界温度，其被分离并脱离。这使得下游引物结合并延伸， 还给予下游和上游引物分枝迀移并延伸产生两个拷贝的双链的机会。
[0136] 探针 如上所述的任意方法还可以包括通过测量可检测信号来监测扩增。可以将检测系统与 作为扩增系统一部分的一种或更多种寡核苷酸相连。检测系统可以是产荧光的。扩增期间 可以产生与信号产生系统同源的序列。
[0137] 许多基于探针的检测系统是本领域已知的，描述在别处，例如WO 2006/087574。这 些系统通常由双重标记的荧光寡核苷酸组成，其包括荧光团和受体部分（其可以是荧光团 或荧光猝灭剂）的FRET对。探针结合序列可以是如图2所示IO扩增子下游的一部分，或 它可以是引物、10、RC和/或DE的一部分。所有这些元件可以包括非同源碱基，可以将它 们设计成被外源元件捕获以定位扩增单元。这与侧向流系统相同。
[0138] 嵌入染料诸如Sybr green I和噻挫橙（thiazole orange)能够对DNA扩增的常 规过程产生信号。可选的或此外可以使用对特定扩增子的扩增产生信号的探针。这样基于 探针的系统可以用于在单个管中多重数种扩增方法。这通过利用针对具有不同类型的输出 的每种系统的探针实现。这通过针对每种探针的不同波长的荧光发射举例说明。多重技术 也是包括内部阴性和阳性实验对照的方法的重要部分。
[0139] 探针系统的实例包括下列： (a)荧光团可以与引物相连，这可以用作Fret受体，其中该系统包括通用嵌入染料。
[0140] (b)荧光团可以与引物相连，这样的话当引物掺入扩增产物时存在可检测的荧光 变化。这可以通过以下方式实现：将两个或更多个荧光团紧密靠近，这样的话它们自我猝灭 或基态猝灭直至掺入扩增产物。
[0141] (c)可以将荧光团和猝灭剂或受体荧光团掺入IO或其DE，这样的话当IO掺入扩 增产物时存在可检测的荧光变化。
[0142] (d)荧光团受体/猝灭剂（FRET)对可以插入扩增系统的元件，这样的话它们通过 可切割的元件分离，其中FRET对的部分通过可切割的元件分离，而可切割的元件受到双链 特异性核酸酶的作用。如果元件掺入扩增产物，该元件的切割将诱导FRET对的完全分离， 从而增强系统的荧光。可切割元件可以是IO的一部分，或它可以是引物系统的一部分或添 加到系统的扩增子并与其同源的附加元件。
[0143] 当可切割元件是引物系统的一部分时，可切割元件可以在引物结合位点的5'端 或引物结合位点的3'端。如果可切割元件被置于部分结合区的3'端，将非同源碱基三引 物置于可切割元件是有利的，这些碱基可以包括荧光团或猝灭剂/受体的粘附。可以将具 有这些性质的引物设计如下：其不是模板扩增系统的一部分，但将包括在任何假象扩增内。 具有这些性质的引物可以用做阴性对照，例如它在3'端或其附近具有与IO同源的区域，产 生图5描述的假象。
[0144] 切割酶通过RNASE-H或8-氧代鸟嘌呤或无碱基核酸内切酶作为示例。通常可切割 元件包括RNA，8-氧代鸟嘌呤或无碱基位点。RNASE-HII家族的酶（包括T. kodakaraensis 的酶）识别DNA-RNA双链中的单一 RNA底物，并使单个RNA碱基插入其同源元件。此外，切 割酶可以是5'-3'核酸外切酶诸如T7 gene6,在这种情况下通过使用硫代磷酸酯元件（除 了包含被切割的荧光团的寡核苷酸的5'方面）防止该系统受到这种酶的作用。
[0145] 当可切割元件插入引物时，它可以是引物模板结合位点的5'边或相对该位点的 3'。当可切割碱基位于引物结合位点的3'端时，它可以被置于最后一个同源碱基或该碱 基的任一边。在该元件3'的所有碱基可以与模板非同源，3'末端可以阻止延伸直至受到 RNASE-H或其他核酸内切酶的作用。显然，重要的是切割后荧光团供体或受体从邻近其伴侣 处被去除，这通过确保切割单元一侧的熔解温度低于系统的环境温度得以实现。
[0146] (e)荧光团和猝灭剂或受体荧光团可以掺入不同的元件，这样的话当掺入扩增单 元时存在可检测的荧光变化。
[0147] 在另一个实施方案中，本发明提供一种等温扩增核酸靶分子的试剂盒，包括上游 引物、下游引物、链插入系统和寡核苷酸，其中上游和下游引物不是扩增过程期间链插入系 统的底物，并且没有链插入系统就不扩增靶分子，其中寡核苷酸是链插入系统的底物。该试 剂盒的每个元件，包括优选的特征，在上面被详细描述。例如，优选的特征可以包括：链插入 系统包括重组酶系统和/或寡核苷酸在其3'末端包括下游元件。 实施例
[0148] 实骀步驟 试剂和溶液 UVSX 和 UVSY 按照先前的描述（Timothy Formosa and Bruce M. Alberts; JBC Vol. 261，6107-6118，1986)进行纯化。
[0149] RNASHHI-KOD-I 按照先前的描述（Haruki M et. al. J Bacteriol. 1998 Dec; 180(23) :6207-14)进行纯化。
[0150] 从下列浓缩物组合测定法。
[0151] 镁缓冲液· 100 mM Tris; 100 mM 醋酸镁；20 mM DTT; pH 8. 0 50〇1111((1;[-1'1^8-)磷酸肌酸（3181]^)利用氨水调节口!1到7.8。
[0152] 200 mM DTT，溶于 H2O IOOx BSA (10 mg/ml)，溶于 H2O 100 mM ATP-二钠盐（Jena Biosciences)，溶于 H2O 10 mM dNTPs (Sigma D7295) 50% PEG 1000 (w/v) (Fluka)，溶于 H2O 2 M 鹿糖（Fluka)，溶于 H20 肌酸激酶，来自兔肌肉的I型（Sigma C3755)在40%甘油/ 50mM KAc pH8溶解到10 u/ μ 1 肌激酶，来自鸡的肌肉（Sigma Μ3003) 在40%甘油/ H2O中溶解到9 u/ μ I (200x) 焦磷酸酶（Sigma 11643)在 40% 甘油 / H2O 溶解到 0.4 u/μ I (200x) 蔗糖磷酸化酶（Sigma S0937)在40%甘油/ H2O中溶解到0. 4 u/ μ I UvsX, UvsY; 100 μ Μ,溶于 300 mM 醋酸钾；50% 甘油. gp32 (NEB, 10 mg/ml) Klenow, excT (Jena Biosciences, 50 u/ μ 1)使用终浓度为 0· 05 u/ μ I
【主权项】
1. 用于ATP再生的组合物，其包含重组酶、蔗糖和蔗糖磷酸化酶。
2. 权利要求1的组合物，其进一步包含磷酸肌酸和肌酸激酶。
3. 权利要求1或2的组合物，其进一步包含肌激酶和/或焦磷酸酶。
4. 权利要求1的组合物，其中所述重组酶是Uvs X。
5. 权利要求1的组合物用于在等温DNA扩增中ATP再生的用途。
6. 用于在等温DNA扩增中链插入的试剂盒，其包含寡核苷酸和重组酶，其中所述寡核 苷酸在3'端包含至少一个2' -O-甲基RNA核苷酸。
7. 权利要求6的试剂盒，其中所述寡核苷酸包含与靶序列的部分互补的部分。
8. 权利要求6或7的试剂盒，其中所述寡核苷酸包含至少30个核苷酸。
【专利摘要】本发明涉及等温核酸扩增。一种扩增核酸靶分子的等温方法，其依赖于上游引物、下游引物、链插入系统和寡核苷酸，其中上游和下游引物不是扩增过程期间链插入系统的底物，并且没有链插入系统就不扩增靶分子，其中寡核苷酸是链插入系统的底物。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104862385
【申请号】CN201510103597
【发明人】M.J.霍瑟
【申请人】基因排列技术有限公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2009年6月11日
【公告号】CA2727212A1, CN102119225A, CN102119225B, EP2304054A1, EP2660336A1, US9062344, US20110123991, WO2009150467A1