为突出链（OS)，其基本上与双链的同源链分离，变成单链。因此当插入 区外的残余双链具有导致Tm低于环境温度的长度和序列的情况下，完整的双链将解离产 生两个单链末端（其可以结合末端引物）。
[0094] 大部分重组酶从寡核苷酸的5'区向其3'区聚合，一旦包被的寡核苷酸插入双链， 则SIS继续聚合到插入寡核苷酸的3'的双链(下游)。插入系统的包被元件比未包被区结 合更紧密。还值得注意的是与模板（被重组酶包被）结合的引物不能被延伸，直至重组酶 去聚合（depolymerised)并被除去。
[0095] 作为上述观察的结果，如果IO的模板双链末端上游接近插入区，则所述末端将分 离，因为它没有包被重组酶，引物可能结合并延伸置换10,这样的话它可以被所述系统再次 使用。在相同情况下，下游末端将结合在一起，直至重组酶去聚合/脱离（falls off)(其 也是按照5'到3'方向）。如果下游末端的Tm比环境温度更高，则其链甚至在重组酶去聚 合后仍然相连，但链仍将分离，因为上游引物延伸并置换初始双链的链。这使得下游引物随 后能够结合和延伸（图2)。
[0096] 如果上游末端不接近插入区但下游末端的相邻足够接近以允许熔解，则可以预料 下游末端将在重组酶去聚合后分离。意外的是情况不是这样，因为当重组酶去聚合置换插 入的寡核苷酸、在其伴侣上重新定位突出链并重新形成初始双链时，双链的闭合上游末端 分枝迀移并且不给下游引物结合提供机会。在这种情况下，分枝迀移是快速的，因为突出链 仍然以具绞旋线的构象围绕复合物，即使被置换时仍与其同源链紧密相连。
[0097] 这些事件的后果是对于有效的系统来说，SIS实现双链分离，然后靶双链的上游末 端必须在链插入事件期间分离。这通过确保邻近插入位点的双链上游区具有接近或低于环 境温度的熔解温度得以实现。这可以由技术人员使用标准技术轻易确定，但受到系统成分 诸如单链结合蛋白、金属离子浓度和盐浓度的影响。
[0098] 因此，应当优选的将IO设计为：其与靶分子互补，在同源区的任一边只留下约 10-20个碱基，优选的约15-17个碱基。因此，例如，当所述应用在40°C进行时，给系统提供 不可延伸的10,这样的话其在同源区的任一边留下双链的10-17个碱基。当IO插入时，双 链的上游末端（相对于插入寡核苷酸）熔解，而3'末端结合在一起，这归因于重组酶在下 游双链上的插入依赖性聚合。上游引物结合熔解的双链上游末端并延伸，从而置换10。双 链的下游末端可以通过上游引物的连续延伸而分离，或其足够短以致当重组酶去聚合时它 也发生熔解。
[0099] 上文方案描述了重组酶按5' -3'方向（上游到下游）聚合的结果。此处说明描述 了利用这类重组酶的扩增。当使用按相反方向聚合的重组酶时，然后该系统的配置也是 颠倒的。大部分重组酶倾向于IO上游末端的12-15个碱基的区域以促进重组酶的接种 (seeding)，可以包括这一特征，这样的话IO包括上游非同源区。
[0100] 在上述方法中，尽管扩增假象被降到最低，但是引物有可能在IO上非特异性拷 贝，并且这种延伸的产物可以被置换，如图5所示在其他引物上拷贝。
[0101] 图5显示通过其引物假象可以在不包括下游元件的三部分系统中存在的机制。
[0102] 5A:诱导假象扩增的系统成分包括上游引物（I)，中间寡核苷酸（II)和下游引物 (III) 5B:下游引物偶尔可以在中间寡聚物上拷贝。
[0103] 5C :任意其他的寡核苷酸引物可以在下游引物占据的位置上游的中间物上拷贝。
[0104] :其他寡核苷酸引物的延伸将导致下游引物延伸产物的置换。
[0105] 5E :最后，如果上游引物在置换的产物上拷贝，则可以产生可扩增的单元。
[0106] 这些事件比那些涉及图1描述的双引物系统的引物二聚体假象产生的事件更复 杂，这导致用于评价待测模板存在的系统的灵敏性高于只依赖于双引物的系统。
[0107] 尽管这类事件是罕见的，但所得的寡核苷酸序列将有可能是可扩增单元。但是，这 种偶然性将被下文描述的本发明实施方案消除。为了消除非特异扩增的任何可能性，可以 利用下列现象。
[0108] 当由于IO的插入导致只有双链的一端被分离时，同源引物可以结合解离的末端， 但部分栓系的突出链仍保持非常接近。因为突出链还包括与引物相同的区域，其能够与引 入的引物竞争结合模板。此外，在重组酶去聚合后栓系的末端也可以分枝迀移，在结合分离 末端的引物有机会延伸前恢复初始双链。在这些情况以及只有上游末端被熔解时，上游引 物的延伸受到影响，变成依赖于下游末端的分离，这样的话双链的链不再栓系并脱离。通过 这种方法，消除突出链的竞争。因此，可以将系统设计成：无论双链上游方面的分离与否，上 游引物只在下游末端也被分离的条件下是有效的。该系统对两个末端分离的依赖增加了系 统的特异性，可以通过以下方式实现：改变有利于突出链恢复的上游引物的能力，或使用低 浓度的聚合酶或具有弱的链置换活性（Klenow exo-活性）的聚合酶，因为这也将影响引物 延伸与双链恢复的平衡。无论如何当双链的两条链分离时，发现扩增基本上更快。因此如 果特定靶的扩增诱导链分离，不给予这一性质的假象扩增将被超越。
[0109] 上游引物的能力可以通过数种机制改变，例如： (i)可以将上游引物设计成与插入IO重叠。重叠的区域优选的是约5到10个核苷酸。 重叠引物的延伸将依赖于引物在模板上的预先分枝迀移置换10。在一些情况下，具体的是 存在单链结合蛋白的情况下，分枝迀移是缓慢的并暂停引物的延伸，这样的话引物的结合 和延伸对起始双链的恢复（re-instatement)的竞争有利于恢复。该实施方案的另一个优 点是如果长度大于18-23个碱基，则邻近IO的末端不分离。这样的话熔解温度高于反应的 环境温度（其中为约40°C )。该构建体中描述的引物具有高于该数值的Tm，但产生具有低 于环境温度的Tm的末端。如果使用这类引物，其可以结合熔解双链的同源末端，其3'区将 分枝迀移到双链的插入方面（如果其是同源的），随后在聚合酶的作用下延伸。如果引物变 成非特异性/不依赖模板的产物的一部分，除非它用IO区精确定位，否则它不可能是有效 的扩增单元。
[0110] (ii)上游引物可能被暂时阻断，延伸前依赖酶促切割。这通过以下例证：3'阻断 的引物包括邻近3'末端的RNA碱基以及RNAse H。使用选择性核酸内切酶的类似系统可以 用做减缓引物进展的任意机制。
[0111] 在如上所述的实施方案中，扩增变成依赖于下游末端以及上游末端的熔解。设计 为依赖下游末端熔解的系统可以添加对扩增的绝对特异性。如果下游引物的Tm高于环境 温度，则下游末端不会熔解，另外非特异性的假象产物不会扩增。这是使用这类引物的一个 优点，但仍存在以下问题：具有超过反应环境温度的Tm的引物如何诱导将分离的末端。这 通过利用其他附加的序列依赖性元件熔解下游末端来实现。
[0112] 例如，可通过一种或更多种附加寡核苷酸（其通过插入寡核苷酸促进靶双链的分 离，其功能取决于IO插入步骤）的结合分离下游栓系的末端。这种方法的价值在于这类寡 核苷酸可以被设计成能结合和分离双链，但既不是聚合酶的底物也不是重组酶的底物。这 类寡核苷酸无法参与引物假象的产生，因为它不是聚合酶底物，如图5所示这是重要的。优 选的所述附加的寡核苷酸结合IO释放的链，分枝迀移入邻近的双链核酸。重要地当其功能 要求分枝迀移并且发现分枝迀移被单链结合蛋白抑制时，其可以被设计成不显著结合单链 结合蛋白。该方法通过以下举例说明： (i) IO包括是其3'末端（下游元件，DE)延伸的序列，其与靶末端区同源，如图3所示 以及下文的描述。
[0113] 在该实施方案中，DE包括元件，其不是聚合酶底物，任选的既不是重组酶底物也不 是SSB底物。通常这可以通过利用2'修饰的核苷酸实现。2'位的典型修饰包括羟化，甲基 化和烷化。它可选的可通过碱基糖或磷酸盐成分的修饰（产生模板和/或引物无效的性质） 进行诱导。合适的元件包括RNA和RNA类似物，诸如锁核酸（LNA)，吗啉代，肽核酸（PNA)以 及实现杂交的其他核酸修饰。这些寡核苷酸是不同的，因为它们具有不同的主链糖但仍然 根据Watson和Crick配对与RNA或DNA结合，但不能扩增，因为聚合酶无法识别它们。重 要的是该元件能够与其靶序列杂交。
[0114] DE可以是IO的延伸，能够分枝迀移插入部分的下游，干扰剩余双链并留下具有低 于环境温度的Tm的完整双链区，分离双链，这样的话引物可以结合和延伸。在下游引物和 DE之间存在同源重叠。重要的是DE和下游引物无法彼此拷贝，这样的话DE不应是引物，也 不应是聚合酶的模板底物，即它不应允许引物在超过其与IO的接头的区以及在IO上结合 和延伸。DE的3'末端任选的可具有附加的假（spurious)碱基和/或被阻断延伸以促进其， 例如通过将不可延伸的单元置于其3'末端或通过在该区域添加非同源碱基。通常通过掺 入一个或更多个数种修饰的核苷酸阻断3'末端的延伸。通常这将掺入末端核苷酸的3'修 饰。这些修饰核苷酸的实例是双脱氧核苷酸，3'氨基-烯丙基，不同长度的3'-碳间隔物， 相反方向掺入的核苷酸（3'-3'键），3'磷酸，3'生物素，3'salyl，3'-巯基。可选的所述末 端可以包括不适合被聚合酶延伸的核苷酸，这是因为它们较差的作为底物的能力，诸如PNA 或LNA或2' -5' -连接的DNA或2' -0-甲基RNA。
[0115] (ii)可以提供附加的寡核苷酸（反向互补序列，RC)，其具有与IO 3'区同源的3' 区，以及与靶末端同源的5'区，如图4所示以及下文的描述。
[0116] 反向互补序列具有与IO 3'区同源的3'区，并在该区域结合突出的模板链。RC的 5'末端与邻近IO区的靶双链同源并在突出链上。3'区应当足够长以结合突出链，并足够 稳定以诱导其5'方面分枝迀移入邻近的双链。通常该3'区长度应为10-20个碱基，优选 的10-14个碱基。
[0117] 重要的是它不显著干扰IO的功能，因为它与该寡核苷酸同源，其优选包括不是重 组酶底物的碱基，诸如2'修饰的元件，RNA或2-0-甲基RNA或PNA或LNA。此外该寡核苷 酸不是聚合酶的模板是有帮助的。在存在系统组件的条件下，5'区应能按照类似于下游元 件的方式分枝迀移入邻近的双链。为这个目的优选的该区域包括不是单链结合蛋白的底物 的修饰。
[0118] RC与下游引物指向相同方向，因此其与该元件的相互作用是不重要的。与下游元 件相比，RC结合双链的相反链，因此下游引物将与RC重叠但不与其同源。因为RC与IO的 一部分同源，以下对于IO来说可能是优点：被阻断延伸(例如用假3'碱基或如上所述)和/ 或在其3'末端(不与模板同源)具有一些附加的碱基。这将防止IO形成可扩增单元。对于 RC的3'末端也是如此，为这个目的可以在RC的3'末端将其阻断以进一步避免延伸，可以 在其3'末端（不与模板同源）包括一些附加的碱基。
[0119] 图3显示一种扩增方法，其中下游元件用于防止非特异性的扩增产物。
[0120] 3A :该系统的元件如I-IV所示。双链模板如虚线所示。I代表上游引物；II代 表插入寡核苷酸（IO) ;ΙΠ 代表下游元件（DE)，其是IO的3'延伸，可以正在其3'末端包 括非同源碱基。与IO不同，该下游元件不是聚合酶的底物，也可以不是重组酶的底物。IV 代表下游引物。
[0121] 扩增的