一种用于指导铂类药物用药的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于指导钼类药物用药的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 现阶段临床上进行化学药物治疗常见的难题是肿瘤耐药和化疗药物的毒副反应。 化疗未来的发展方向是实现根据肿瘤的反应以及宿主毒副反应的个体化治疗模式。钼类抗 癌药物(主要指顺钼、卡钼和奥沙利钼；顺钼的全称为顺式-二氯二氨合钼，卡钼的全称为 顺二氨环丁烷钼，奥沙利钼的全称为左旋反式二氨环已烷草酸钼）是目前临床应用中对多 种癌症具有较高活性的抗癌药物。顺钼（cisplatin)自从上世纪70年代被发现可以抑制 肿瘤细胞生长后，就广泛应用于癌症化学治疗。顺钼临床应用已经超过30多年，与博来霉 素（bleomycin)、依托泊苷（etoposide)联用治疗睾丸癌效果显著。第二代钼类抗癌药物卡 钼（carboplatin)与顺钼结构极其相似，其作用机理和耐药方面也有共同点，两者皆用于 治疗卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈癌、宫颈癌、淋巴癌等，但因为毒性和耐药性限制了顺钼、 卡钼的使用范围。奥沙利钼（oxaliplatin)是第三代钼类抗癌药，其疗效好、毒性小，而且 与顺钼、卡钼无交叉耐药，特别是在治疗结肠癌、肺癌、乳腺癌方面均有较好的治疗效果。
[0003] 钼类抗癌药物进入细胞后，通过解离失去酸根负离子(如氯离子或者草酸根离 子)，同时结合两分子的水，形成带正电荷的水合钼。带正电荷的水合钼可以跟细胞内亲质 子的分子(包括DNA、RNA和蛋白质）结合。钼原子选择性地与DNA分子中的鸟嘌呤和腺嘌 呤上的N7原子结合，形成3种不同结构的复合物，即单加合物、链内配对交联、链间配对交 联，但几乎大部分结构都是链内配对交联，即l，2-d(GpG)交联。所有的交联都会使DNA发 生扭转，从而破坏DNA的结构，阻碍DNA合成与复制，从而抑制肿瘤细胞生长。这类药物耐 药有多种因素参与，其中DNA切除修复、核苷酸切除修复（NER)和碱基切除修复（BER)能力 加强，是钼类化疗耐药性产生的主要机制之一。
[0004] NER是DNA损伤修复的主要途径，钼类抗肿瘤药物所致的DNA损伤，主要通过NER 通路进行修复。NER过程中与钼类耐药有关的基因有ERCC1、ERCC2、ERCC5等，其中最关键基 因是ERCC1。ERCC1，即切除修复交叉互补基因 l(ex_cision repair cross-completionl), 位于人类19号染色体上，参与DNA链的切割和损伤识别。
[0005] SNP的存在影响到不同个体ERCCl的表达。现在研究较多的ERCCl的SNP是ERCCl 基因第118位密码子上的一碱基由C到T的变异（又称C118T点突变)。法国学者Viguier J对91名接受含钼类化疗的转移性结直肠癌患者进行ERCCl基因 Cl 18T点突变的多态性分 析，具有TT基因型的患者对含有钼类药物化疗的敏感性明显高于具有CT和CC基因型的患 者，而在接受不含钼类药物治疗的患者中未发现ERCCl基因 C118T点突变的多态性对化疗 敏感性有影响。Ryu等对109例接受以钼类药物为基础化疗NSCLC的患者进行了 ERCCl基 因 C118T点突变的多态性分析，具有CC基因型患者中位生存时间与变异型CT或TT的中位 生存时间的差异有统计学意义。Cox多因素模型分析ERCCl基因 C118T点突变的多态性与 化疗敏感性差异有统计学意义。这些结果都提示：ERCCl基因 Cl 18T点突变的CC基因型患 者对钼类药物较其他两种敏感，有较好的预后。
[0006] 参与BER的基因主要是X线修复交叉互补基因 1，即XRCCl (X-ray repair cross complementary gene, XRCCl )。XRCCl通过与多聚二磷酸腺苷（ADP)核糖聚合酶、DNA连接 酶III及DNA多聚酶β作用修复包括顺钼在内的各种理化因素引起的DNA损伤，对维持基因 组的稳定十分重要。DNA修复能力和XRCCl基因表型的变化有关，由于存在单核苷酸多态 性（SNP)，不同个体的XRCCl活性不一样，可能导致不同个体间修复能力的差异，从而影响 对钼类药物的敏感性。
[0007] XRCCl基因最常见的多态性是密码子194的碱基突变(又称R194W点突变)。袁苑 等研究发现，XRCCl基因的R194W点突变的多态性与晚期非小细胞肺癌（NSCLC)对钼类药 物敏感性有关。
[0008] 谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs)是一组具有多种生理功能的同功酶家族。GST-π是 GSTs的一个亚型，主要功能为细胞解毒，它可催化亲电物质与谷胱甘肽结合，其本身又可 与亲脂性细胞毒药物结合增加其水溶性、促进其代谢及药物排泄而降低抗癌药的作用，另 外还可促进DNA的修复，从而使细胞产生耐药。
[0009] GSTPl是谷胱甘肽转移酶超基因家族中π家族（GST-π)的成员之一，是肿瘤细 胞中表达量最为普遍、最常见的GSTs同工酶。Goekkua等发现，GSTPl基因的I105V点突 变的多态性对胃癌患者接受含顺钼药物化疗敏感性产生影响，Val/Val的患者化疗有效率 (67%)明显高于Ile/Ile和Ile/Val(21%)的患者，而Val/Val患者的中位生存时间（15 个月）也明显高于Ile/Ile和Ile/Val (6个月）的患者。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种用于指导钼类药物用药的试剂盒。
[0011] 本发明保护一种引物组，由引物对甲、引物对乙和引物对丙组成；所述引物对甲由 序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述引 物对乙由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成； 所述引物对丙由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分 子组成。
[0012] 本发明还保护所述引物组在制备用于鉴定ERCCl基因的Cl 18T点突变、XRCCl基 因的R194W点突变和GSTPl基因的1105V点突变的试剂盒中的应用。
[0013] 本发明还保护所述引物组在制备用于指导钼类药物用药的试剂盒中的应用。
[0014] 本发明还保护一种用于鉴定ERCCl基因的C118T点突变、XRCCl基因的R194W点 突变和GSTPl基因的I105V点突变的试剂盒，包括所述引物组。所述试剂盒还可包括阳性 对照质粒。所述阳性对照质粒可为将具有ERCCl基因的C118T点突变的DNA分子插入出 发质粒得到的重组质粒甲、将具有XRCCl基因的R194W点突变的DNA分子插入出发质粒得 到的重组质粒乙和将具有GSTPl基因的I105V点突变的DNA分子插入出发质粒得到的重 组质粒丙。所述重组质粒甲具体可为将序列表的序列7所示的双链DNA分子插入pMDlS-T 质粒的多克隆位点（如SmaI和HindIII酶切位点之间）得到的重组质粒。所述重组质粒乙 具体可为将序列表的序列8所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的多克隆位点（如SmaI 和HindIII酶切位点之间）得到的重组质粒。所述重组质粒丙具体可为将序列表的序列9 所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的多克隆位点（如SmaI和HindIII酶切位点之间） 得到的重组质粒。所述试剂盒还可包括阴性对照。所述阴性对照具体可为水，如去离子水。 所述试剂盒还可包括用于提取基因组DNA的试剂或试剂盒。所述试剂盒还可包括用于进行 DNA测序的试剂、试剂盒或仪器。
[0015] 本发明还保护一种用于指导钼类药物用药的试剂盒，包括所述引物组。所述试剂 盒还可包括阳性对照质粒。所述阳性对照质粒可为将具有ERCCl基因的C118T点突变的 DNA分子插入出发质粒得到的重组质粒甲、将具有XRCCl基因的R194W点突变的DNA分子插 入出发质粒得到的重组质粒乙和将具有GSTPl基因的I105V点突变的DNA分子插入出发质 粒得到的重组质粒丙。所述重组质粒甲具体可为将序列表的序列7所示的双链DNA分子插 入PMD18-T质粒的多克隆位点（如SmaI和HindIII酶切位点之间）得到的重组质粒。所述 重组质粒乙具体可为将序列表的序列8所示的双链DNA分子插入pMDlS-T质粒的多克隆位 点（如SmaI和HindIII酶切位点之间）得到的重组质粒。所述重组质粒丙具体可为将序列 表的序列9所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的多克隆位点（如SmaI和HindIII酶切 位点之间)得到的重组质粒。所述试剂盒还可包括阴性对照。所述阴性对照具体可为水，如 去离子水。所述试剂盒还可包括用于提取基因组DNA的试剂或试剂盒。所述试剂盒还可包 括用于进行DNA测序的试剂、试剂盒或仪器。
[0016] 以上任一所述的ERCCl基因的Cl 18T点突变的具体含义为：序列表的序列7所示 DNA分子自5'末端第438位核苷酸由C突变为T。以上任一所述的ERCCl基因的C118T点 突变的具体含义为：以人的基因组DNA为模板，采用所述引物对甲进行PCR扩增，PCR扩增 产物自5'末端第438位核苷酸由C突变为T。
[0017] 以上任一所述的XRCCl基因的R194W点突变的具体含义为：序列表的序列8所示 DNA分子自5'末端第58位核苷酸由C突变为T (相应的氨基酸由R突变为W)。以上任一 所述的XRCCl基因的R194W点突变的具体含义为：以人的基因组DNA为模板，采用所述引物 对乙进行PCR扩增，PCR扩增产物自5'末端第58位核苷酸由C突变为T (相应的氨基酸由 R突变为W)。
[0018] 以上任一所述的GSTPl基因的1105V点突变的具体含义为：序列表的序列9所示 DNA分子自5'末端第217位核苷酸由A突变为G (相应的氨基酸由I突变为V)。以上任一 所述的GSTPl基因的1105V点突变的具体含义为：以人的基因组DNA为模板，采用所述引物 对丙进行PCR扩增，PCR扩增产物自5'末端第217位核苷酸由A突变为G (相应的氨基酸 由I突变为V)。
[0019] 以人基因组DNA为模板，采用所述引物对甲、所述引物对乙或所述引物对丙进行 PCR扩增，特异性良好，不会交叉扩增人类基因组其他区域。
[0020] 所述钼类药物具体可为顺钼、卡钼和奥沙利钼中的至少一种。
[0021] 本发明提供的试剂盒可用于检测与钼类药物敏感性相关的三个SNP位点，进而可 以用于临床指导钼类药物的个体化使用，提高临床治疗的针对性和可预见性。应用本发明 提供的试剂盒进行检测，具有稳定性高、操作简便、成本低廉、结果准确、可实现高通量等优 点。本发明的试剂盒能够实现产业化，能够满足临床检验试剂工作的要求，利于实现安全合 理有效的钼类药物用药个体化给药。
【附图说明】
[0022] 图1为引物对甲的灵敏度检测中的琼脂糖凝胶电泳图。
[0023] 图2为引物对乙的灵敏度检测中的琼脂糖凝胶电泳图。
[0024] 图3为引物对丙的灵敏度检测中的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0025] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实