长非编码rna h19与癌症铂类化疗药物耐药相关性的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学和制药领域，具体涉及长非编码RNA H19与癌症铂类化疗药 物耐药相关性。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌死亡率仍居妇科肿瘤之首。尽管卵巢癌治疗方案不断改进，如手术切除范 围的扩大、紫杉醇和铂类药物的联合化疗，但死亡率仍居高不下，据报道III期患者的五年生 存率仅为29%。究其原因，除了早期诊断困难外，化疗耐药是影响卵巢癌患者存活率的重要 因素。目前在卵巢癌化疗方案中，铂类药物是临床上首选药物之一。虽然卵巢癌患者对以 铂类为主的联合化疗首次有效率达到70% -80%，但大部分患者都会在今后的化疗中产生 继发性耐药。因此如何预测耐药，如何避免发生耐药，以及如何逆转耐药和开发针对耐药肿 瘤细胞的新药等，不仅是当前研究的热点，也将是今后卵巢癌研究中的长期任务。
[0003] 卵巢癌耐药机制的深入理解是解决临床耐药问题的基础，也是改善化疗效果的关 键。已有的实验结果显示卵巢癌对铂类药物耐药性产生的机制可能和以下因素有关：1) 肿瘤细胞对铂类药物的吸收减少、排出增强或药物作用失效：北京协和医院潘凌亚课题组 的研究发现，卵巢癌钼类耐药特异性标记蛋白Annexin A3通过降低细胞内钼含量及钼一 DNA结合量而导致细胞产生耐药。2)DNA损伤修复系统相关：铂类药物引起的DNA损伤主 要通过核苷酸切除修复途径，例如切除修复交叉互补基因 I(ERCCl)和ERCCl基因的表达 产物与DNA修复酶缺乏互补基因 F(XPF)形成紧密的异二聚体（ERCC1/XPF)基因等来矫 正。同时DNA同源修复途径和DNA聚合酶相关基因也与铂类药物抗性有关，如乳腺癌1号 (BRCAl)，DNA聚合酶eta等。因此，DNA损伤修复系统在铂类敏感细胞中往往是有缺陷的。 3)细胞凋亡途径相关：细胞凋亡信号通路的异常和顺铂抗性有关。P53低表达或Mdm2高表 达使肿瘤细胞对顺铂不敏感。4)信号通路相关：铂类耐药机制也与相关信号通路有关，如 Cadherins/catenins和PTEN/PI3K/AKT等信号通路，PI3K抑制剂增加耐药株对顺铂的敏 感性。5)miRNAs相关:miR-128在卵巢癌顺铂耐药细胞株SK0V3/CP中低表达，在该细胞株 中过表达miR-128降低ABCC5和Bmi-I蛋白表达，也使得该细胞对顺铂的敏感性增加。虽 然我们对卵巢癌铂类耐药机制有了比较多的了解，但是离解决临床耐药问题还有一定的距 离，对其耐药机制还需展开深入的研究。
[0004] 最近研究发现一些长片段非编码RNA(long noncoding RNA, IncRNA)参与了肿瘤 细胞对DNA损伤时的应答。Huarte等研究发现IncRNAs在p53途径中起重要作用，其中 lincRNA-p21在DNA损伤时作为p53的靶基因起作用；lincRNA-p21进一步与hnRNP-K互 相作用调控下游系统基因表达，从而影响细胞凋亡。另一个长片段非编码RNA PANDA，也是 P53的靶基因，在DNA损伤时被诱导；PANDA进一步和转录因子NF-YA互作引起细胞周期停 滞。又如Cdc281ncRNA在逆境下能诱导⑶C28表达，而⑶C28表达量增加使细胞容易在逆 境消除后重新进入细胞周期等。由此可见，长片段非编码RNA广泛参与了 DNA损伤应答的 各个环节。而铂类药物主要与DNA交联，诱发DNA损伤，从而引起系列生物学效应。因而， 长片段非编码RNA有可能参与了卵巢癌铂类耐药的作用机理。但关于长片段非编码RNA与 铂类耐药相关的研究至今还未见报道。
[0005] H19基因编码一个2. 3kb的非编码RNA分子，包含5个外显子，是最早发现的 印迹基因之一。长非编码RNA H19的序列（如SEQ ID NO: 1所示）可以从GeneBank数 据库查阅获知，其在NCBI数据库，Nucleotide子库中的登录号为NR_002196. 2。已有研 究发现H19广泛参与各种生理病理过程。H19的表达受上游2到4kb处的印记调控区 (imprintingcontrolregion，ICR)和上下游的增强子调控，印记调控区包括差异甲基化区 (differentiallymethylatedregion，DMR)和沉默元件（silencer element)，DMR 能结合 CTCF绝缘子蛋白。在母系遗传的等位基因，DMR区结合CTCF，H19通过其上下游增强子激 活。而在父系遗传的等位基因，DMR区被甲基化，H19转录被沉默元件抑制。虽然在细胞质 及细胞核内都能检测到H19分子，但H19主要存在于细胞质内，其不仅参与了胚胎发育调 控，还以抑癌基因或癌基因角色参与多种肿瘤发生发展。国外学者发现长链非编码H19在 多种肿瘤中异常表达，如膀胱癌等多种恶性肿瘤，并发现其具有原癌活性。但也有研究认为 H19具有抑癌活性，可以抑制肿瘤的恶性增殖、侵袭转移和肿瘤新生血管的形成。因此，H19 参与肿瘤发生发展的机理可能是比较复杂的。另外，至今为止，H19参与卵巢癌顺铂耐药的 情况以及具体作用机制尚未见诸报道。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于：通过研究长非编码RNA H19与癌症铂类化疗药物 耐药相关性，提供长非编码RNA H19在制备治疗或预防癌症的药物、用于诊断癌症发生或预 测癌症复发的试剂盒中的应用，以及提供长非编码RNA H19在调控癌症的铂类化疗药物耐 药性、预测、检测或诊断癌症患者的铂类化疗药物耐药性中的应用。
[0007] 本发明的一个方面在于提供能够减少和/或抑制癌细胞中的长非编码RNA H19表 达的药剂在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
[0008] 本发明的一个方面在于提供能够减少和/或抑制癌细胞中的长非编码RNA H19表 达的药剂在制备降低癌症的铂类化疗药物耐药性的药物中的用途。
[0009] 例如：
[0010] 就本发明的上述用途，所述药剂优选自：抑制所述长非编码RNA H19表达的反义 RNA或特异切割所述长非编码RNA H19的核酶。
[0011] 就本发明的上述用途，所述药剂优选自：抑制所述长非编码RNA H19表达的小分 子化学药剂。
[0012] 在本发明上述用途的一些实施方案中，根据本发明的反义RNA，其包含能够特异结 合所述长非编码RNA H19或其互补序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列，优选所述 反义RNA包含与H19的一个或多个部分互补的序列区域，更优选地所述反义RNA包含与全 长H19完全互补的DNA序列，优选地，所述反义核苷酸是DNA或者RNA或者其衍生物，最优 选地，所述反义RNA包含在能够表达其的表达质粒，优选真核表达质粒中。
[0013] 在本发明上述用途的一些实施方案中，所述药剂优选为对所述长非编码RNA H19 进行定向干扰的慢病毒质粒。
[0014] 在本发明上述用途的一个实施方案中，优选构建所述慢病毒质粒所用的对所述长 非编码RNA H19进行定向干扰的核苷酸序列如下：
[0015] 正义链如SEQ ID NO:6所示；
[0016] 反义链如SEQ ID NO:7所示。
[0017] 本发明的另一个方面在于提供能够检测长非编码RNA H19表达的药剂在制备用于 诊断癌症发生或预测癌症复发的诊断或预测试剂盒中的用途。
[0018] 本发明的另一个方面在于提供能够检测癌细胞中的长非编码RNA H19表达的药剂 在制备用于检测癌细胞的铂类化疗药物耐药性或诊断癌症患者的铂类化疗药物耐药性的 检测或诊断试剂盒中的用途。即，一般地，可以检测癌细胞株或从癌症患者获得的肿瘤活检 组织中长非编码RNA H19的表达量，并将所得的量与预定的阈值进行比较，由此预测或预后 所述癌细胞和癌症患者是否具有铂类化疗药物耐药性。
[0019] 就本发明的上述用途，所述药剂选自对所述长非编码RNA H19具有检测特异性的 核苷酸探针或PCR引物。
[0020] 在本发明上述用途的一个实施方案中，所述的对所述长非编码RNA H19具有检测 特异性的PCR引物的核苷酸序列优选如下：
[0021] 正义链如SEQ ID NO:2所示；
[0022] 反义链如SEQ ID NO:3所示。
[0023] 本发明的再一个方面在于提供一种药物组合物，包含前述的能够减少和/或抑制 癌细胞中的长非编码RNA H19表达的药剂或者前述的能够检测癌细胞中的长非编码RNA H19表达的药剂。
[0024] 在本发明的所有方面，如果适用的话，优选的是