检测TOPO IIa mRNA相对表达量的引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，更具体的是一种实时荧光定量PCR技术检测 TOPO IIa mRNA相对表达量的方法。
【背景技术】
[0002] DNA拓扑异构酶IIa(topoisomerase IIa)是控制DNA的拓扑状态的一类酶蛋白， 存在于细胞核内，可以降低DNA超螺旋和扭转，在这一过程中DNA形成一个双链缺口，可使 双链DNA通过这个缺口，然后重新连接起断裂的DNA链，从而达到解开超螺旋的目的，为进 一步解链复制等做准备。
[0003] 目前诸多研宄表明TOPO IIa是肺癌、乳腺癌、白血病等多种恶性肿瘤化疗药物的 作用靶点，而该类药物种类诸多，根据作用方式不同分为嵌人型和非嵌人型两类。嵌人型抑 制剂系通过其分子中类似嗓吟碱或嗜吮碱的多环结构嵌人到TOPO IIa与DNA结合部位的 双链之间，从而干扰了该酶将DNA断端重新接合的正常功能，进而影响DNA的复制，激活了 细胞内一系列导致细胞死亡的过程，细胞发生凋亡或坏死，从而抑制肿瘤生长。如葱环类抗 生素阿霉素等，在临床实验中对肺小细胞癌、白血病、胸腺癌和卵巢癌均有显著疗效。非嵌 人型抑制剂其作用模式还不十分清楚，可能是直接作用或是仅仅与双链DNA中的一条链结 合以影响酶功能。如VP16是鬼臼毒素的衍生物，治疗支气管肺癌最有效。
[0004] 肿瘤药物的药效是化疗成功的关键因素，而Tope II a表达量直接影响了 TOPO IIa抑制剂的作用效果。Giacconc研宄了 8株人肺癌细胞株中TOPO IIa基因的表达与其对 VP 16 (鬼臼乙叉甙）、ADM的药敏性的关系，发现7株细胞株中TOPO IIa基因的表达明显减 少，与其相对耐药明显相关，未发现该基因扩增，表明该基因编码的蛋白的调节是一种翻译 后调节。耐ADM的SCLC细胞株GLC4ADR150中，TOPO IIa活性的减低亦导致耐药。Eijdems 发现，起源于人的非小细胞肺癌（NSCLC)细胞株的耐ADM的细胞株SW 1573/ADM中Tope II a表达不稳定，对化疗较敏感。此外，许多at-MDR细胞系包括SCLC细胞系，其TOPO IIa活 性和表达量下降2~4倍，就可明显引起药物诱导致TOPO IIa介导的DNA断裂下降。根据 这些研宄结果充分表明了细胞内TOPO IIa含量越高，则对TOPO IIa抑制剂的敏感性越高， 对DNA损伤越严重。
[0005] 在临床检测中，用于检测TOPO IIa表达量的方法主要为免疫组化，尽管该法原理 简单，但是试验过程过于繁琐，所需的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判 读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。实时荧光定量PCR法具有 较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR过程进行实时检测，结果可反映出TOPO IIa在组织 中的初始含量，检测周期短且还避免了遗留污染的发生。目前用于实时荧光PCR的常见方 法有SYBR GreenI染料法及Taqman探针法。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性 不如Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性。因此本研宄采用实时荧光PCR技 术应用于TOPO IIa mRNA相对表达量检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于，提供了一种用于检测TOPO IIa mRNA相对表达量的核苷酸，所 述核苷酸包括扩增引物和探针，特异性检测TOPO IIa基因的扩增引物序列为SEQ NOl和 SEQ N02及其探针序列SEQ N03 :
[0007] SEQ NOl ：CCACTTCTGATGATTCTGACTCT ；
[0008] SEQ N02 ：CATCTGACTCTTCCAGGTACTT ；
[0009] SEQ N03 ：FAM-CGAAAGCAGTCACAAGCAAGAAATCCAAG-TAMARA〇
[0010] 特异性检测ACTIN基因的扩增引物序列为SEQ N04和SEQ N05及其探针序列SEQ N06 ：
[0011] SEQ4 : TGAGCGAGGCTACAGCTT ;
[0012] SEQ5 ：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT ；
[0013] SEQ6 ： FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA 〇
[0014] 本发明还提供一种检测TOPO IIa mRNA相对表达量的方法，包括：
[0015] ⑴提取样本中的RNA ;
[0016] (ii)用逆转录试剂将步骤⑴中得到的RNA进行反转录为cDNA ;
[0017] (iii)使用2对引物及相应探针（SEQ1-SEQ6)对步骤（ii)得到的cDNA进行实时 荧光定量PCR检测；
[0018] (iiii)结果分析；
[0019] 其中所述，特异性检测TOPO IIa基因的扩增引物序列为SEQ NOl和SEQ N02及其 探针序列SEQ N03 :
[0020] SEQ NOl ：CCACTTCTGATGATTCTGACTCT ；
[0021] SEQ N02 ：CATCTGACTCTTCCAGGTACTT ；
[0022] SEQ N03 ：FAM-CGAAAGCAGTCACAAGCAAGAAATCCAAG-TAMARA〇
[0023] 特异性检测ACTIN基因的扩增引物序列为SEQ N04和SEQ N05及其探针序列SEQ N06 ：
[0024] SEQ4 ： TGAGCGAGGCTACAGCTT ；
[0025] SEQ5 ：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT ；
[0026] SEQ6 ：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA 〇
[0027] 进一步的，步骤（iii)所述的具体步骤为：检测体系为25ul，其中包括12. 5ul qPCR Mix，0.4ul IOuM探针SEQ3和SEQ6，10uM正、反向引物各0.8ul，其中正向引物为SEQl 和 SEQ4,反向引物为 SEQ2 和 SEQ5,50XR0X 0. 5ul，cDNA2ul，ddH20 8ul ;实时荧光定量 PCR 反应程序：95°C IOmin预变性；95°C 15sec，58°C 35sec (收集信号），39个循环。
[0028] 本发明还提供了一种检测TOPO IIa mRNA相对表达量的试剂盒，包括逆转录试剂、 实时荧光定量PCR扩增反应试剂；阳性质控品及阴性质控品，所述扩增反应试剂包括引物 和探针，其中特异性检测TOPO IIa基因的扩增引物序列为SEQ NOl和SEQ N02及其探针序 列 SEQ N03 :
[0029] SEQ NOl ：CCACTTCTGATGATTCTGACTCT ；
[0030] SEQ N02 ：CATCTGACTCTTCCAGGTACTT ；
[0031] SEQ N03 ：FAM-CGAAAGCAGTCACAAGCAAGAAATCCAAG-TAMARA〇
[0032] 特异性检测ACTIN基因的扩增引物序列为SEQ N04和SEQ N05及其探针序列SEQ N06 ：
[0033] SEQ4 ：TGAGCGAGGCTACAGCTT ；
[0034] SEQ5 ：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT ；
[0035] SEQ6 ：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA〇 ；
[0036] 进一步的，所述逆转录试剂包括 5 X RT-Buffer，IOOuM Primer Mix，100U/ul ReverTra Ace逆转录酶和DEPC水；所述实时荧光定量PCR试剂还包括qPCR Mix，50 XROX ; 阳性质控品为含TOPO IIa基因溶液；阴性质控品为不含TOPO IIa基因溶液。
[0037] 有益效果：实时荧光PCR表达量检测实验需要引物及探针具有较好的特异性及灵 敏度，从而保证结果的准确度。本发明中所涉及的引物及探针均