br>[0161] 图4显示了2,3,4,6-四乙酷基-1-六化二醇)-葡萄糖-CPG何控多孔玻璃）的完整 合成路线。
[0162] 图5显示了 1，3,4,6-四乙酷基-N-乙酷基半乳糖胺（图2的化合物1)的醒R分析结 果。
[0163] Ih 醒R(300MHz，DMS0-d6);7.91~7.86(d，lH)，5.66~5.61(d，lH)，5.28~5.25 (d，lH)，5.10~5.03(d，lH)，4.25~4.19(t，lH)，4.15~3.94(m，3H)，2.12~2.10(s，3H), 2.04~2.02(s，3H)，2.00~1.98(s，3H)，1.91~1.89(s，3H)，1.78~1.76(s，3H)
[0164] 图6显示了3,4,6-S乙酷基-I-六（乙二醇)-N-乙酷基半乳糖胺（图2的化合物2)的 NMR分析结果。
[01 化]Ih NMR(300MHz，CDCl3);6.66~6.61(d，lH)，5.33~5.29(d，lH)，5.02~4.96(d, lH)，4.80~4.75(d，lH)，4.25~4.07(m，2H)，3.93~3.79(m，2H)，3.73~3.54(m，24H)，2.16 ~2.14(s，3H)，2.05~2.03(s，3H)，1.99~1.97(s，6H)
[0166] 图7显示了3,4,6-S乙酷基-I-[六（乙二醇）-N'-r，2'-丙二醇]-N-乙酷基-半乳 糖胺(图2的化合物3)的NMR分析结果。
[0167] Ih NMR(300MHz，CDCl3);6.83~6.78(d，lH)，6.10~6.08(s，lH)，5.33~5.29(d, lH)，5.00~4.94(d，lH)，4.82~4.77(d，lH)，4.22~4.08(m，4H)，3.94~3.85(m，2H)，3.83 ~3.74(m，lH)，3.66~3.52(m，24H)，3.40~3.24(m，2H)，2.18~2.16(s，W)，2.05~2.03 (s，3H)，2.00~1.98(s，3H)
[016引图8显示了3,4,6-S乙酷基-1-[六（乙二醇)-N'-r-甲氧基（二甲氧基S苯甲基)-2'-丙醇]-N-乙酷基半乳糖胺(图2的化合物4)的NMR分析结果。
[0169] Ih 醒R(300MHz，DMS0-d6);7.80~7.75(d，lH)，7.40~7.20(m，9H)，7.00~6.98 (s，lH)，6.90~6.85(d，4H)，5.22~5.20(s，lH)，5.00~4.87(m，2H)，4.58~4.55(d，lH), 4.04~4.02(s，4H)，3.94~3.82(m，lH)，3.74~3.72(s，W)，3.51~3.49(s，24H)，3.18~ 3.12(m，lH)，2.94~2.85(m，2H)，2.11~2.09(s，3H)，2.00~1.98(s，3H)，1.90~1.88(s, 3H)，1.78~1.76(s，3H)
[0170] 图9显示了3,4,6-S乙酷基-I-[六（乙二醇）-N'-r-甲氧基（二甲氧基S苯甲 基)-2'-丙氧基(班巧酸）]-N-乙酷基半乳糖胺(图2的化合物5)的NMR分析结果。
[0171] iHMffi(300MHz，CDCl3);7.43~.38(d，2H)，7.31~7.19(m，7H)，6.84~6.79(d, 4H)，6.75~6.67(t，lH)，5.52~4.89(m，lH)，5.32~5.30(s，lH)，5.21~5.19(s，lH)，5.01 ~4.95(d，lH)，4.81~4.76(d，lH)，4.30~4.08(m，3H)，3.93~3.86(m，2H)，3.79~3.77(s, 細），3.66~3.52(m，24H)，3.36~3.32(m，lH)，3.21~3.17(d，2H)，2.75~2.56(m，4H)，2.18 ~2.16(S，3H)，2.04~2.Ol(m，細），1.98~1.96(S，3H)
[0172] 图10显示了与配体结合的寡核巧酸结构的结构及其实施例即单-NAG-(六乙二 醇)n-寡核巧酸-脂质及引入到其中的脂质的结构。
[0173] (A)与配体结合的寡核巧酸结构的结构。
[0174] (B)单-NAG-(六乙二醇)n-寡核巧酸-脂质的结构。
[0175] 图11显示了单-NAG-(六乙二醇)广寡核巧酸-脂质的质谱(MALDI-T0F MS)结果。
[0176] (单-NAG-(六乙二醇H-寡核巧酸-脂质的分子量(MW 7807.4))。
[0177] 图12显示了单-NAG-(六乙二醇)2-寡核巧酸-脂质的质谱(MALDI-T0F MS)结果。 [017引（单-NAG-(六乙二醇)2-寡核巧酸-脂质的分子量(丽8152.7))。
[0179] 图13显示了单-NAG-(六乙二醇)3-寡核巧酸-脂质的质谱(MALDI-T0F MS)结果。
[0180] (单-NAG-(六乙二醇)3-寡核巧酸-脂质的分子量(MW 8498.0))。
[0181] 图14显示了单-NAG-(六乙二醇)4-寡核巧酸-脂质的质谱(MALDI-T0F MS)结果。
[0182] (单-NAG-(六乙二醇)4-寡核巧酸-脂质的分子量(MW 8843.3))。
[0183] 图15为通过对本发明的与各自具有相同分子量的亲水性材料结合的双链寡RNA结 构的纳米颗粒(SAMiRNA)的临界胶束浓度进行测量所获得的图形。
[0184] 图16为通过对本发明的与各自具有相同分子量的亲水性材料结合的双链寡RNA结 构的纳米颗粒(SAMiRNA)的粒度和多分散性指数进行测量所获得的图形。
[0185] (n表示亲水性材料单体的重复数目，且双链寡RNA结构的纳米颗粒由相应的结构 形成。）
[0186] 图17显示了在用本发明的与各自具有相同分子量的亲水性材料结合的双链寡RNA 结构的纳米颗粒(SAMiRNA)进行处理的细胞系中对祀标基因表达的抑制程。
[0187] (n表示亲水性材料单体的重复数目，且双链寡RNA结构的纳米颗粒由相应的结构 形成。）
[018引实施例
[0189] W下，本发明将根据下述实施例进行详细的描述。运些实施例仅用于示例说明本 发明，且对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的范围不应该被理解为局限于运些实 施例。
[0190] 实施例1.制备(3'N-乙酷基半乳糖胺)CPG(可控多孔玻璃)
[0191] 为了制备与配体连接的双链寡RNA结构，制备了 N-乙酷基半乳糖胺CPG，其为配体 材料且可与双链寡RNA结构结合。
[019。实施例1-1.制备1-六(乙二醇)-N-乙酷基半乳糖胺-CPG(可控多孔玻璃)试剂
[0193] 为了将N-乙酷基半乳糖胺(NAG)与双链寡RNA结构结合，如图2所示制备了 1-六（乙 二醇)-N-乙酷基半乳糖胺-CPG(可控多孔玻璃）。
[0194] 实施例1-1-1.制备1,3,4,6-四乙酷基-NAG(图2的化合物1)
[01巧]将起始物质即半乳糖胺盐酸盐（Sigma Aldrich ,USA) (IOg ,46.37mmol )、乙腊 (150ml)和S乙胺(556.48ml)彼此混合并回流I小时。将混合物缓慢冷却至室溫，使用冰水 冷却至(TC并逐滴加入乙酸酢(43.83ml，463.70mmol)。加完后，移去冰水并将混合物在室溫 揽拌24小时。反应完成后，缓慢加入饱和碳酸氨钢水溶液直到抑为中性。pH为中性后，将混 合物在室溫揽拌2小时得到固体，将所得固体过滤并将滤液先后用乙酸乙醋、蒸馈水和乙酸 乙醋洗涂。将固体真空干燥得到1，3，4，6-四乙酷基-NAG(9.792g，56 % )(参见图2)。
[01 %] 实施例1-1-2.制备3,4,6-S乙酷基-1-六（乙二醇)-N-乙酷基半乳糖胺（图2的化 合物2)
[0197]将由实施例1-1-1得到的1，3，4,6-四乙酷基-N-乙酷基-半乳糖胺（6.77g, 18.04111111〇1)、氯化铁（111)(3.80旨，23.45111111〇1)和二氯甲烧(2001111)彼此混合并在室溫揽拌。 揽拌10分钟后，向其中加入六（乙二醇）（5.90ml，4.82mmo 1)并回流2小时。反应完成后，将 混合物用娃藻±过滤并将滤液用二氯甲烧洗涂。将滤液减压浓缩并加入乙酸乙醋和蒸馈水 W萃取水层。将所得水层用二氯甲烧萃取并收集有机层并用无水硫酸儀干燥且过滤。将滤 液减压浓缩并真空干燥得到3,4,6-S乙酷基-1-六（乙二醇)-N-乙酷基-半乳糖胺(2.24g, 74.9%)(参见图 3)。
[0刪 实施例1-1-3.制备3,4,6-S乙酷基-1-[六（乙二醇)-N'-r，2'-丙二醇]-N-乙酷 基半乳糖胺(图2的化合物3)
[0199] 将由实施例1-1-2获得的3,4，6-S乙酷基-1-六（乙二醇）-N-乙酷基半乳糖胺 (13.66g，22.33mmo 1)加到乙腊(220ml)中并揽拌。向其中加入N，N ' -二班巧酷亚胺基碳酸醋 (9.15旨，35.73111111〇1)和^乙胺（9.901111，71.46111111〇1)并揽拌24小时。将3-氨基-1，2-丙二醇 (3.26g，35.73mmol)用N，N'-二甲基甲酯胺（60ml)稀释，向其中加入S乙胺（4.95ml， 35.73mmol)并将混合物加到反应溶液中并揽拌24小时。将混合物减压浓缩并真空干燥。将 混合物通过柱分离并将获得的溶液减压浓缩。将所得混合物真空干燥得到3,4,6-S乙酷 基-1-[六(乙二醇)-N'-^，2'-丙二醇]-N-乙酷基半乳糖胺(9.23g，56.7%)(参见图4)。
[0200] 实施例1-1-4.制备3,4,6-S乙酷基-1-[六（乙二醇)-N'-r-甲氧基(二甲氧基S 苯甲基)-2 丙醇]-N-乙酷基半乳糖胺(图2的化合物4)
[0201] 将由实施例1-1-3获得的3,4,6-;乙酷基-1-[六化二醇)-N'-r，2'-丙二醇]-N-乙酷基半乳糖胺(9.23g(12.67mmol，leq))加到二氯甲烧（120ml)中并揽拌。向其中加入S 乙胺（5.27ml (38. OOmmol，3eq))。加入稀释在二氯甲烧（20ml)中的DMT-Cl (4.72g, 13.93mmol)并将混合物揽拌24小时。将混合物减压浓缩，用乙酸乙醋萃取，用无水硫酸儀干 燥且过滤。将滤液减压浓缩。将混合物通过柱分离并将获得的溶液减压浓缩。将所得混合物 真空干燥得到预期的3,4,6-S乙酷基-1-[六（乙二醇)-N'-r-甲氧基-二甲氧基S苯甲基-2丙醇]-N-乙酷基-半乳糖胺(7.77g，59.5%)。
[020。实施例1-1-5.制备3,4,6-S乙酷基-1-[六（乙二醇)-N'-r-甲氧基(二甲氧基S 苯甲基)-2'-丙氧基(班巧酸）]-N-乙酷基半乳糖胺(图2的化合物5).
[0203]将由实施例1-1-4获得的3,4,6-S乙酷基-1-[六（乙二醇)-N'-r-甲氧基(二甲氧 基；苯甲基)-2'-丙醇]-N-乙酷基半乳糖胺(7.72g，7.487mmol)加到邮晚(70ml)中并揽拌。 向其中加入乙酸酢(3.75g，37.486mmol)和014口(0.46邑，3.745臟〇1)并将混合物在60至701： 揽拌24小时。将混合物减压浓缩并真空干燥。将混合物用乙酸乙醋萃取。将混合物用无水 硫酸儀干燥且过滤。将滤液减压浓缩。将滤液通过柱分离并将获得的溶液减压浓缩。将所得 混合物真空干燥得到预期的3,4,6-S乙酷基-I-[六化二醇)-N'-r-甲氧基（二甲氧基S 苯甲基)-2'-丙氧基(班巧酸）]-N-乙酷基-半乳糖胺(7.61g，89.9%)。
[0204] 实施例1-1-6.在封端3，4,6-S乙酷基-1-六（乙二醇)-N-乙酷基半乳糖胺-CPG前 制备CPG化合物(图2的化合物6)
[0205] 将由实施例1-1-5获得的3,4,6-S乙酷基-1-[六（乙二醇)-N'-r-甲氧基(二甲氧 基S苯甲基)-2'-丙氧基（班巧酸）]-N-乙酷基-半乳糖胺(0.34g，0.30mmol)加到长链烷基 胺-可控多孔玻璃化CAA-CPG)(l()0()A)(5g)、二-2-氧代-3-嗯挫烷基麟酷氯（0.2g， 0.45111111〇1)、1-径基苯并立挫（0.06邑，0.45111111〇1)和二氯甲烧（501111)。向其中加入立乙胺 (0.03ml，2.25mmol)。将混合物反应24小时。将混合物过滤并用甲醇洗涂。将混合物干燥得 到预期的CPG化合物（4.91g)，然后封端3,4,6-S乙酷基-1-六（乙二醇）-N-乙酷基半乳糖 胺-CPG。
[020y 实施例1-1-7.制备3，4,6-S乙酷基-1-六（乙二醇)-N-乙酷基-半乳糖胺-CPG(可 控多孔玻璃）（图2的化合物7).
[0207]将在封端3，4,6-S乙酷基-1-六化二醇)-N-乙酷基半乳糖胺-CPG前由实施例1-1-6获得的CPG化合物(4.86g)加到化晚（30ml)、乙酸酢（6.02ml ,63.70mmol)和1-甲基咪挫 (5.08ml ,63.70mmol)中并反应24小时。将混合物过滤并用甲醇洗涂。将滤液真空干燥得到 预期化合物即3,4,6-S乙酷基-1-六（乙二醇）-N-乙酷基半乳糖胺-CPG(可控多孔玻璃） (2.8g)〇
[020引实施例2.制备双链寡RNA结构
[0209] W下，为了抑制存活素，使用针对存活素的双链寡RNA。存活素作为在至今测试的 大多数肿瘤或变异细胞系中通常表达的蛋白被预期是癌症治疗中的重要祀标(Survivin:a new target for anti-cancer therapy.Cancer Treat Rev.2009Nov;35(7):553-62)。
[0210] 本发明的针对存活素的双链寡RNA由具有SEQ ID NO: I的有义链及具有与其互补 的序列的反义链构成，且用作对照组的双链寡RNA由具有SEQ ID NO: 2的有义链及具有与其 互补的序列的反义链构成。在本发明的实施例中使用的双链寡RNA的碱基序列如下：
[0211] (沈Q ID NO: 1)5'-AAG GAG AUC AAC AUU UUC A-3'
[0212] (沈Q ID NO:2)5'-CUU ACG CUG AGU ACU UCG A-3'
[0213] 在双链寡RNA中，双链寡RNA的单链通过W下方法合成，所述方法使用0-氯基乙基 亚憐酷胺连接憐酸二醋键，从而形成RNA骨架结构（PoIymer suppo;rt oligonucleotide synthesis XVIII :use of beta-cyanoethyI-N,N-dia IkyI amino-/N-morpholinophosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection 曰nd isol曰tion of the fin曰I product.Nucleic Acids Res.1984Jun ll;12(ll):4539-57)。
[0214] RNA单链的预期序列可如下获得:使合成方法起始于