共价键(X或Y)结合于寡核巧酸。介导共价键的衔接物在寡核巧酸的端部 共价结合于由结构式（1)和(2)中的(Am-J)n或(J-Am)n表示的亲水性材料嵌段或疏水性材料 且不受具体限制，只要根据需要提供可在具体环境下分解的键。因此，用于在制备寡核巧酸 结构中进行结合W活化寡核巧酸和/或亲水性材料(或疏水性材料)的任何化合物可用作衔 接物。共价键可为不可降解的键或可降解的键中的任何一种。在此，不可降解的键的实例可 包括酷胺键或憐酸化键，且可降解的键的实例可包括二硫键、酸可降解的键、醋键、酢键、生 物可降解的键或酶可降解的键等，但是本发明无须仅限于此。
[0083] 在本发明的结构式（1)至(6)中，当使用双链寡核巧酸且具体为双链寡RNA时，双链 寡RNA与亲水性材料嵌段和疏水性材料的键合可W是各种各样的，如在下表3的结构式7至 18中所示。
[0084] 表3.本发明优选的双链寡RNA与亲水性和疏水性材料的键合的类型
[0085]
[0086]
[0087] 在表3中，S表示双链寡RNA的有义链，AS表示双链寡RNA的反义链，且pAS表示与憐 酸基团连接的反义链。剩余的A、B、X、Y、L、Z、n和m与在结构式(1)和(2)中的定义相同。
[0088] 具体地，由结构式(4)表示的本发明的寡核巧酸结构优选具有由W下结构式（19) 表示的结娩.
[0089]
[0090] 在结构式（19)中，A为亲水性材料单体，B为疏水性材料，L为与通过由受体介导的 内吞作用(RME)促进祀标细胞内摄的受体特异性结合的配体，Z为介导亲水性材料单体和配 体之间的键的衔接物，R为单链或双链寡核巧酸，m为1至15的整数，n为1至10的整数，且A、B、 L、R等与在本说明书的结构式(4)中的定义相同。
[0091] 具体地，A为选自在表1中所示的化合物（1)至(3)的任何一种物质，且Z优选为化合 物(4)。
[0092] 在本发明的另一个方面，本发明提供由W下结构式(20)表示的固体载体：
[0093]
[0094] 在结构式(20)中，L与在结构式(3)和(4)中的定义相同，且T与在化合物(4)中的定 义相同。此外，C和D中的一个为固体载体，另一个为二甲氧基=苯甲基，E和F各自独立地为1 至10的整数，且i表示0或1。
[0095] 在本发明的另一个方面，本发明提供通过使用由结构式(20)表示的固体载体来制 备由结构式(1)至(4)表示的寡核巧酸结构的方法。
[0096] 所述方法通过使用由本发明的结构式(20)表示的固体载体来制备由结构式（1)至 (4)表示的寡核巧酸结构，且当寡核巧酸为单链时，所述方法包括：
[0097] (1)将亲水性材料嵌段Wn次重复共价结合于由结构式(20)表示的固体载体；
[0098] (2)基于与亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链寡核巧酸；
[0099] (3)将疏水性材料共价结合于与亲水性材料嵌段结合的寡核巧酸的5 '端;和
[0100] (4)将寡核巧酸结构与固体载体分开。
[0101] 在本发明中，固体载体包括可控多孔玻璃(CPG)、聚苯乙締、硅胶、纤维素纸等，但 是本发明不限于此。当固体载体为CPG时，直径优选为40至180皿且优选具有500至3000A 的孔径。
[0102] 此外，当本发明的寡核巧酸结构的寡核巧酸为双链RNA时，双链寡核巧酸优选由19 至31个核巧酸构成。可用于本发明的双链寡核巧酸可为与用于基因疗法或基因研究或具有 用于基因疗法或基因研究的可能性的任何基因相关的任何双链寡核巧酸。
[0103] 本发明提供由在表3中所示的结构式(7)至（10)和（13)至（16)表示的双链寡核巧 酸(RNA)结构及其制备方法。具体地，所述方法通过使用由本发明的结构式(20)表示的固体 载体来制备由结构式(7)至（10)和（13)至（16)表示的寡核巧酸结构，且当寡核巧酸为双链 时，所述方法包括：
[0104] (1)将亲水性材料嵌段Wn次重复共价结合于由结构式(20)表示的固体载体；
[0105] (2)基于与亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链RNA;
[0106] (3)将疏水性材料共价结合于与亲水性材料嵌段结合的RNA的5 '端；
[0107] (4)将RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA与固体载体分开;和
[0108] (5)通过对RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA进行退火形成双链 寡核巧酸。
[0109] 更优选地，所述方法包括：
[0110] (1)基于由结构式(20)表示的固体载体结合亲水性材料嵌段；
[0111] (2)将步骤(1)重复n-1次；
[0112] (3)基于与亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链RNA;
[0113] (4)将疏水性材料结合于单链RNA的5 '端；
[0114] (5)当合成完成时，将RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA与固体载 体分开并纯化;和
[0115] (6)通过对RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA进行退火来制备双 链寡RNA结构。
[0116] 在W上步骤(5)后，当制备完成时，预期的RNA-聚合物结构和单链RNA是否被制备 可通过使用高效液相色谱化PLC)纯化反应混合物并使用MLDI-TOF质谱测量其分子量来证 实。在制备方法中，具有与在步骤(3)中合成的单链RNA的序列互补的序列的单链RNA可在步 骤(1)之前合成或可在步骤(1)至(5)中的任何一步期间合成。
[0117] 此外，当憐酸基团结合于结构式(8)或（14)所示的反义链的5'端时，憐酸基团可在 制备方法的步骤(6)之前或之后结合于反义链的5'端。
[0118] 此外，本发明提供与配体结合的由结构式(9)、（10)、（15)和（16)表示的双链寡RNA 结构及其制备方法。具体地，通过使用由结构式(20)表示的固体载体来制备双链寡RNA结构 的方法包括：
[0119] (1)基于由结构式(20)表示的固体载体Wn次重复共价结合亲水性材料嵌段；
[0120] (2)基于通过步骤（1)合成的与配体-亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链 RNA ；
[0121] (3)将疏水性材料共价结合于步骤(2)所获得的物质的5'端；
[0122] (4)当合成完成时，将与配体结合的单链RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列 的单链RNA与固体载体(CPG)分开并纯化;和
[0123] (5)通过对与配体结合的RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA进行 退火来形成双链寡RNA结构。
[0124] 在W上步骤(5)后，当制备完成时，预期的与配体结合的RNA-聚合物结构和单链 RNA是否被制备可通过使用高效液相色谱化PLC)纯化反应混合物并使用MALDI-TOF质谱测 量其分子量来证实。在制备方法中，具有与在步骤(2)中合成的单链RNA的序列互补的序列 的单链RNA可在步骤(1)之前合成或可在步骤(1)至(4)中的任何一步期间合成。
[0125] 此外，当憐酸基团结合于结构式（10)或（16)所示的反义链的5'端时，憐酸基团可 在制备方法的步骤(6)之前或之后结合于反义链的5'端。
[0128] 在由结构式(21)表示的物质中，C和D中的一个为二甲氧基S苯甲基，且另一个为氯基乙基亚憐酷胺。
[0126] 在另一个方面，本发明提供使用物质制备由结构式（21)表示的物质和由结构式 (1)至(4)表示的寡核巧酸结构的方法。结构式(21)与结构式(20)的区别仅在于取代基C和 D：
[0127]
[0129] 所述方法通过使用由本发明的结构式(21)表示的物质来制备由结构式（I)至(4) 表示的寡核巧酸结构，且当寡核巧酸为单链时，所述方法包括：
[0130] (1)使用与官能团结合的固体载体且优选为CPG合成单链寡核巧酸；
[0131] (2)基于与寡核巧酸结合的固体载体Wn次重复共价结合亲水性材料单体；
[0132] (3)将由结构式(21)表示的物质共价结合于与亲水性材料结合的寡核巧酸的5' 端；
[0133] (4)将寡核巧酸聚合物结构与固体载体分开;和
[0134] (5)通过结合于由步骤(4)获得的寡核巧酸结构的3'端的官能团共价结合疏水性 材料。
[0135] 此外，所述方法通过使用由本发明的结构式(21)表示的物质来制备由结构式（1) 至(4)表示的寡核巧酸结构，且当寡核巧酸为双链时，所述方法包括：
[0136] (1)使用与官能团结合的固体载体且优选为CPG合成单链寡核巧酸；
[0137] (2)基于与寡核巧酸结合的固体载体Wn次重复共价结合亲水性材料单体；
[0138] (3)将由结构式（21)表示的物质共价结合于与亲水性材料结合的寡核巧酸的5' 端；
[0139] (4)将RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA与固体载体分开；
[0140] (5)通过结合于由步骤(4)获得的寡核巧酸结构的3'端的官能团共价结合疏水性 材料;和
[0141] (6)通过对RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA进行退火来形成双 链寡核巧酸结构。
[0142] 此外，当憐酸基团结合于反义链的5'端时，憐酸基团可在制备方法的步骤(6)之前 或之后结合于反义链的5'端。
[0143] 在另一个方面，本发明提供由结构式（1)至(6)中的任何一个表示的寡核巧酸结构 所形成的纳米颗粒。所述寡核巧酸为两亲性的，其含有疏水性材料和亲水性材料两者，其中 由n个亲水性材料嵌段构成的亲水性部分通过相互作用诸如氨键等而与存在于体内的水分 子具有亲和性W朝向外部，而疏水性材料通过之间的疏水性相互作用而朝向内部，由此形 成热力学上稳定的纳米颗粒(SAMiRNA)。也就是说，疏水性材料位于纳米颗粒的中屯、，而亲 水性材料嵌段位于寡核巧酸的外部方向，由此形成保护双链寡RNA的纳米颗粒(参见图1)。 如上形成的纳米颗粒可改善寡核巧酸的细胞内递送且改善对可用于治疗疾病的寡核巧酸 的基因表达进行控制的效能。
[0144] 此外，由于可容易地控制亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体及其单体数目，且 也可容易地控制待使用的亲水性材料嵌段的数目，因此在所有寡核巧酸结构中由n个亲水 性材料嵌段构成的亲水性材料部分彼此相同，由此具有所述亲水性材料部分的寡核巧酸 结构具有W下优势:材料分析是容易进行的，且合成方法与通过使用亲水性材料并通过额 外的纯化操作W具有相同的分子量而合成的寡核巧酸结构相比是简单的，且可降低成本。
[0145] 此外，由于由寡核巧酸结构形成的纳米颗粒的尺寸可通过控制亲水性材料嵌段的 重复数目及亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体来调节，因此基于寡核巧酸形成的纳米颗 粒可具有显著可再现的细胞递送能力。
[0146] 此外，在配体具体为糖类诸如N-乙酷基半乳糖胺(NAG)、甘露糖、葡萄糖等且寡核 巧酸结构由结构式（I)或(2)表示的情况下，与配体结合的寡核巧酸可使在亲水性材料嵌段 的重复数目降低时减弱的亲水性得W同时补充和增强，由此使纳米颗粒的形成得W稳定。 如上形成的与配体结合的纳米颗粒可改善寡核巧酸的细胞内递送并改善可用于治疗疾病 的寡核巧酸的效能。由寡核巧酸结构形成的纳米颗粒的更具体的合成和表征、细胞内递送 效能及作用将通过W下实施例更详细地描述。
[0147] 此外，本发明提供使用寡核巧酸结构或基于寡核巧酸结构形成的纳米颗粒的治疗 方法。具体地，所述治疗方法包括制备由寡核巧酸结构形成的纳米颗粒并将所述纳米颗粒 给予到动物体内。
[0148] 此外，本发明提供药物组合物，其包含药学有效量的由寡核巧酸结构形成的纳米 颗粒。
[0149] 本发明的组合物可如下制备：除了上述用于给药的有效成分之外，额外地包含至 少一种类型的用于给药的药用载体。药用载体需要与本发明的有效成分相容。可使用选自 W下的一种成分:盐水、无菌水、林格溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、糊精-麦芽糖复合剂溶 液、甘油、乙醇或其中两种或更多种的混合物。此外，可根据需要向其中加入其它常规添加 剂诸如抗氧化剂、缓冲剂、抑真菌剂等。此外，可通过向其中额外地加入稀释剂、分散剂、表 面活性剂、粘合剂和润滑剂将组合物制备成注射用制剂诸如水溶液、混悬液、乳液等。此外， 在本领域中适当的方法或在Remington'S pharmaceutical Science,Mack Publishing company,化Ston PA中公开的方法可优选用于配制，运取决于各种疾病或成分。
[0150] 可基于一般患者的症状和疾病严重度由本领域一般专家确定本发明的药物组合 物。此外，组合物可被配制成各种类型诸如粉末剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、注射剂、软膏剂、 糖浆剂等且可按单位剂量或多剂量容器的形式提供，例如密封的安飯、瓶等。
[0151] 本发明的药物组合物可口服或胃肠外给药。本发明的药物组合物的给药途径的实 例可包括口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、屯、内、经皮、皮下、腹膜内、肠内、舌下或 局部给药，但是本发明不限于此。
[0152] 对于上述临床给药，本发明的药物组合物可通过已知的技术制备成适当的制剂。 本发明的组合物的给药量具有不同的范围，运取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮 食、给药时间、方法、排泄速率、疾病严重度等且可由本领域一般专家容易地确定。
[0153] 本发明提供使用所述寡核巧酸结构调节体内或体外基因表达的方。此外，本发明 提供使用含有所述寡核巧酸结构的纳米颗粒调节体内或体外基因表达的方法。
[0154] 有利的作用
[0155] 本发明的寡核巧酸结构可具有全部相同的亲水性材料部分，使得在连接于寡核巧 酸的亲水性材料为合成性聚合物时出现的多分散性特征所引起的问题诸如质量控制等可 得W显著的改善。此外，相比于现有的使用多分散性亲水性材料的纯化方法，制备本发明的 寡核巧酸结构的方法可W是简单的，可降低合成成本且可容易地对寡核巧酸结构进行物质 分析。此外，纳米颗粒的粒度可通过控制亲水性材料嵌段的重复数目和在每个亲水性材料 嵌段中的亲水性材料单体来调节。
[0156] 具体地，当本发明的寡核巧酸结构中的配体额外地结合于通过由受体介导的内吞 作用(RME)促进祀标细胞内摄的受体时，向祀标细胞的递送可更有效地进行。此外，当配体 为糖时，连同纳米颗粒的祀向效果，取决于亲水性材料嵌段的重复数目而降低的亲水性可 得W补充W改善寡核巧酸的细胞内递送且改善对寡核巧酸基因表达进行控制的效能。
[0157] 此外，在寡核巧酸结构被吸收到细胞中之后，寡核巧酸可容易地由内含体脱离且 可具有抑制被溶酶体分解的作用，由此可通过将氨基或多组氨酸基团引入到亲水性材料嵌 段中而获得更高的治疗效果。
【附图说明】
[0158] 图1为本发明的由与各自具有相同分子量的亲水性材料连接的寡核巧酸结构形成 的纳米颗粒的示意图。
[0159] 图2显示了3,4,6-S乙酷基-1-六（乙二醇)-N-乙酷基-半乳糖胺-CPG(可控多孔玻 璃)的完整合成路线。
[0160] 图3显示了2,3,4,6-四乙酷基-1-六（乙二醇)-甘露糖-CPG(可控多孔玻璃）的完整 合成路线。<