细胞 因子是对它的受体，或如果有可能在不同受体上结合，那么对它的至少一种受体显示强烈 降低的结合活性的修饰的细胞因子。如此处所用的降低的结合亲和力意指亲和力是野生型 细胞因子的小于50%、优选小于40%、更优选小于30%、更优选大于25%、更优选小于20%、 更优选小于15%、更优选小于10%、更优选小于5%、最优选小于1 %。如此处所用的"野生型 细胞因子"意指如它在自然界中在宿主生物体中所存在的细胞因子。对细胞因子的导致结 合亲和力降低的修饰可为使正常野生型细胞因子的活性降低的修饰，或它可为使同源性、 非内源性细胞因子(如但不限于结合人细胞因子受体的小鼠细胞因子）的亲和力增加的修 饰。修饰可为本领域技术人员所知的降低或增加活性的任何修饰，包括但不限于化学和/或 酶修饰，如聚乙二醇化和糖基化、融合于其它蛋白质W及突变。优选地，具有对受体的结合 亲和力降低的细胞因子是突变细胞因子。突变可为本领域技术人员所知的任何突变，包括 缺失、插入、截短或点突变。优选地，所述突变是点突变或点突变的组合。可用为本领域技术 人员所知的任何方法测量亲和力。作为一非限制性实例，配体对受体的亲和力可通过 Scatchard图分析和计算机拟合结合数据（例如Scatchard, 1949 )，或通过如由化echt等 (1993)所述在流通条件下进行反射干设光谱法来测量。
[0019] 或者，降低的结合活性可测量为突变配体相较于野生型配体的生物活性降低。在 一优选实施方案中，使用报告子测定在体外测量所述生物活性。此类报告子测定取决于所 用细胞因子受体系统，并且为本领域技术人员所知。作为一非限制性实例，由Bono等（1989) 连同Scatchard分析一起描述IFN-丫报告子测定。优选地，突变体的生物活性是野生型细胞 因子的小于50%、优选小于40%、更优选小于30%、更优选大于25%、更优选小于20%、更优 选小于15%、更优选小于10%、更优选小于5%、最优选小于1 %。
[0020] 修饰的细胞因子被融合于另一修饰或未修饰的细胞因子。优选地，使用接头序列， 优选是包含一个或多个GGS重复序列的GGS接头使两个细胞因子融合。可将修饰的细胞因子 放置在分子的氨基末端部分中，或簇基末端部分中；融合蛋白可还包含其它结构域，如但不 限于标签序列、信号序列、另一细胞因子或抗体。
[0021] 如此处所用的细胞因子可为本领域技术人员所知的任何细胞因子，包括但不限于 a螺旋束细胞因子家族、S聚肿瘤坏死因子(TNF)家族(I化iss和Naismith ,2000)、半脫氨酸 结生长因子(Sun和Davies, 1995)、包括白介素-1家族的PS叶形折叠组(Murzin等，1992)、 白介素17(IL-17)家族(Gaff en，2011)和趋化因子(Nomiyama等，2013)的细胞因子。在S聚 TNF家族的成员的情况下，优选使用单链形式。此类单链细胞因子为本领域技术人员所知， 并且尤其由Krippner-Heidenrich 等（2008)所述。
[0022] 在一个优选实施方案中，此类融合蛋白是XCLl与iraa2突变体，优选是Ql24R突变 体之间的融合物。在另一优选实施方案中，此类融合物是CCL20与ILie突变体之间的融合 物。优选地，此类ILie突变体是Q148G突变体。在另一优选实施方案中，此类融合物是TN化与 瘦素突变体之间的融合物。优选地，此类瘦素突变体选自由L86S和L86N组成的组。
[0023] 本发明的另一方面是一种用作药剂的根据本发明的融合蛋白。在一个优选实施方 案中，它是用于治疗癌症的根据本发明的融合蛋白。在另一优选实施方案中，它是用于调节 免疫应答的根据本发明的融合蛋白。
[0024] 附图简述
[0025] 图1 :X化l/lFNa2-Q124R融合蛋白中的结构元件的图示。
[0026] 图2:X化l/IFNa2-Q124R融合蛋白对表达XCRl的细胞的选择性活性。
[0027] 测量特征在于表达CDllc和CDSa的不同小鼠脾细胞子组中应答于IF化/0或XCLl/ IFNa2-Q124R融合蛋白的STAT1Y701 憐酸化。第一列：CDllcTDSa+子组；第二列：CDllc-CD8a-子组;第S列：CDllc*CD8a-子组;第四列：CDlIc胃CDSa+子组;第五列：CDlIC胃CDScf子组。 [00%]图3:比-10突变体AXL20融合蛋白中的结构元件的图示。
[0029] 图4:比-10突变体AXL20融合蛋白对表达CCR6的细胞的选择性活性。
[0030] (A)由野生型和5种融合于CCL20的不同IL-10突变体对NFkB活性的诱导。
[0031] (B)在模拟转染细胞或用CCR6转染的细胞中，由野生型和IL-10Q148G突变体/ (XL20融合蛋白对NFkB活性的诱导的浓度依赖性。
[0032] (C)相较于由媒介物达成的诱导，在模拟转染细胞或用CCR6转染的细胞中，由野生 型和比-1K!148G突变体AXL20融合蛋白（12.5ng/ml)对NFkB活性的诱导。
[0033] 图5:scTNFa/瘦素突变体融合蛋白中的结构元件的图示。
[0034] 图6:scTNFa/瘦素突变体融合蛋白对瘦素受体表达性细胞的选择性活性。
[0035] 通过XTT测定来测量Ba/F3-mLR细胞（图A)或Ba/F3-mLR-TNFRl A切t细胞（图B)中 由指示浓度的scTNF祀向WT或突变瘦素诱导的瘦素依赖性生长。
[0036] 图7: IF脚舌性对表达XCRl的小鼠脾细胞的体内祀向。
[0037] 用指示量的XCLl-IFNa2-Q124R，或用1000000个单位的天然鼠类IFNa/e或PBS静脉 内注射巧7B1/6小鼠。在45分钟之后，通过FACS，针对W下细胞群体中的CDl 1C和CDSa表达 (第一张图）W及P-STATl (其它图）来分析脾细胞:CD1 Ic-CDSa-(株系1)、CDllc-CD8a+(株系 2)、CDllc+CD8a+(株系3)、CDllc+CD8a-(株系4)。 实施例
[0038] 实施例的材料和方法
[0039] 克隆和产生融合因子
[0040] 克隆X化l/lFNa2-Q124R融合蛋白。
[0041 ] 使用扩增高保真PCR系统(Roche Diagnostics)和W下引物，通过PCR从编码XCLl 的质粒MR200473(0rigen Inc.)合成X化1开放阅读框：
[0042]正向：5' GGGGGGGAATTCATGAGACTTCTCCTCCTGAC3'
[004；3]反向：5' GGGGGGTCCGGAGGCCCAGTCAGGGTTATCGCTG3'
[0044] PCR产物用EcoR巧邮spEr消化，并且替换为编码pMET7Slg K-HA-1R59B-His-PAS-ybbr-IFNA2-Q124R 载体(PCT/EP2013/050787)中的纳米抗体的 EcoRI-BspEI 片段。
[0045] 产生X化l/lFNa2-Q124R融合蛋白。
[0046] 使用标准Iipofectamin方法（Invitrogen)，用蛋白质融合构建体转染Hek 293T细 胞。在转染之后48小时，收获培养基并储存在-20°C下。使用纯化的纳米抗体GFP-IF化2-Q124R制剂(描述于PCT/EP2013/050787中）作为标准物，如所述化Z自等J.Mol .BioI. 1994)测 定IFN对人化116和鼠类LL171细胞系的活性。
[0047] 克隆IL-lfVCCL20融合蛋白。
[004引通过基因合成（Invitrogen Gene Art)来产生编码成熟人化-10/(XL2O融合蛋白 的密码子优化序列。简言之，合成W下序列：其中使前置有Si排前导肤，并且配备有N末端HA 的成熟人IL-10蛋白在它的C末端融合于13 XGGS接头序列，在接头序列之后是具有C末端 HIS标签的成熟人CCL20的序列（图3)。
[0049]基于文献W及对与它的受体复合的人IL-10的公开晶体结构的分析来选择预期对 化-IR具有降低的结合亲和力的IL-10突变体。使用如下表中指示的诱变引物，通过定点诱 变(如ickOiange，Stratagene)来在h]X-10部分中产生突变：
[(K)加]
[00!
[0化2] 产生比-10突变体:(XL20融合蛋白。
[0化3] 在肥K293T细胞中产生比-10-C化20融合蛋白。对于小规模产生，将肥K293T细胞于 补充有10%FCS的DMEM中在400000个细胞/孔下接种于6孔板中。在24小时之后，用血清减少 的培养基(DMEM/5%FCS)替换培养基，并且使用线性PEI转染细胞。简言之，通过将化g表达 载体与扣g PEI组合于16化1 DMEM中来制备PEI转染混合物，在室溫下解育10分钟，并且逐 滴添加至各孔中。在24小时之后，转染的细胞用DMEM洗涂，并且用1.5ml化tiMem/孔分层 W产生蛋白质。在48小时之后回收条件培养基，经0.4扣过滤器过滤并储存在-20°C下。根据 制造商说明书(R&D Systems)，通过化ISA来测定条件培养基中的IL-10含量。
[0化4]克隆scTNF/瘦素融合蛋白。
[0055] 使用W下引物，通过PCR分别从表达WT瘦素、瘦素 L86S或瘦素 L86N的pMe巧质粒合 成野生型(WT)、L86S和L86N瘦素的编码序列：
[0056] 正向 5'-GCAGCTCTGTCGACATCCAGAAAGTCCAGGATGACACC-3'，
[0057] 反向 5'-CGATGCGGCCGCACATTCAGGGCTAACATCCAACTGT-3'。
[0化引运在瘦素编码序列的氨基和簇基末端处分别引入BgIII和NotI位点。PCR产物用 BgIH和Notr消化，并且克隆至用Bgin和NotI打开的pMET7-SlgK-HA-scTNF WT-6 XGGS-FLAG(WT scTNF通过基因合成（GeneAd)产生）中，其存在于6 XGGS与化AG之间。运产生 pMET7-SlgK-HA-scTNFWT-6XGGS-mLeptin-FLAG、pMET7-Sl^-HA-scTNFWT-6XGGS-mLeptinL86S-化AG和pMET7-SlgK-HA-scTNF WT-6XGGS-mLeptin L86N-化AG。
[0化9]产生scTNF/瘦素融合蛋白。
[0060]使用标准憐酸巧沉淀方法，用不同融合蛋白构建体转染化kT细胞。在转染之后48 小时，收获培养基并储存在-20°C下。用商业hTN阳ELISA(DY210，R&D systems)测定浓度。 [0061 ] 细胞系
[0062] 使Hek 293T、HL11巧化L171细胞系在补充有10%FCS的DMEM中生长。在补充有10% 热