22] *与Williams 82 ISU显著不同 P < 0.001 **与Williams 82 ISU显著不同 P = 0.015 与Wi 11 iams 82相比在溫室中种植后2个月收获的ST-109-2-4大豆植物显示80%提高的 与从新出现S叶的叶子和恰在新出现的S叶下方收获的茎段分离的质膜相关的ENOXl活 性。然而，植株仅高16%并且基部茎直径仅增加5%。转基因 ST-109-2-4和Williams 82植物二 者的质膜ENOXl活性均W约12%响应加入的100 yM半脫氨酸。运些数据证明转基因植物中过 表达的ENOXl到达质膜并且仍响应加入的半脫氨酸但生长响应不成比例地更少。
[0123] 候选植物生长素-活化的ENOX蛋白（dNOX)的鉴定基于还包含已知ENOX蛋白的相应 功能基序的已知生长素-结合蛋白的同源性检索。所选择的20 kDa的氨基酸序列，ABP-20 (图24，SEQ ID NO: 8)，在20 kD的转录物内包含所需的功能基序，包括在G59LGTAG处的潜 在NADH结合位点、位于C44KK的潜在的蛋白二硫键位点W及顺着位于H106TH和L160LH的潜 在的铜位点连同生长素结合基序化06THPGASSVLIVAQ。
[0124] 具有约20 W)a分子量的重组ABP-20的表达通过SDS-PAGE用银染色确认（图25)。
[0125] 蛋白表征:没有生长素添加时重组蛋白在纯化期间都不显示超过NADH自动氧化的 背景速率的NADH氧化酶活性。添加生长素（例如，1 yM 2,4-D)时活性在基线活性之上增强 10-20倍，IEF-纯化级分的平均比活为约0.6 ± 0.2 ymol/min/mg蛋白。
[0126] 对于更详细的评估，在细菌中表达和通过等电聚焦纯化的重组植物ENOXl在每个 1.5 min的1 min内平均的速率清楚地显示ENOXl蛋白特有的对外源提供的NADH的氧化的振 荡模式（图26)。重复模式为5个极大值的重复，其中两个相隔6 min (极大值①和②），剩余 的（极大值③、④和⑤)相隔4.5 min [6 + (4 X 4.5 min) = 24 min]。如来自其它来源的 ENOXl蛋白所特有的，标记为①和②的极大值比极大值③、④和⑤更突出。当用2，4-D代替天 然生长素，吗I噪-3-乙酸（IAA)时获得相似的结果（图27)。
[0127] 如同一般性ENOX蛋白所特有的，该蛋白还显示蛋白二硫键-琉基互换(蛋白二硫键 异构酶)活性，其通过二硫代二化晚基底物的时间-依赖性裂解说明（图28)。观察到与对于 NADH氧化相似的具有24 min的周期长度的振荡模式。如先前所报道的（Morr自，D. J.和 Morr自，D. M.2003.Free Radical Res. 37: 795-808)，用DTDP，标记为③、④和⑤的极大 值比标记为①和②的那些更显著，运提示NADH氧化和蛋白二硫键互换的主要极大值的交 替。
[012引重组ENOXl在标准测定中氧化还原型辅酶Q (图29)，活性在A"o处（图29A)或在A290 处（图29B)测定。就NADH氧化而言（图27)标记为①和②的极大值比标记为③、④和⑤的那些 更显著。质膜的氨酿(对于动物还原型辅酶Q/对于植物还原型辅酶Q或叶绿酿)为ENOX蛋白 的生理学底物。
[0129] 主要通过减少重组蛋白的聚集，取得所报道的比活需要通过等电聚焦进一步纯 化。最高的比活在接近重组蛋白的计算等电点pH 5.19的约5.0的聚焦piH时取得。
[0130] 活性受到硫醇试剂PCMB和PCMS (表12)抑制。无活性的生长素类似物2,3-二氯苯 氧乙酸（2,3-D)没有作用，如ENOXl-特异性苦木苦味素抑制剂苦木内醋D-样(表12)。抑制 生长素诱导的生长但不控制植物生长(Morr自，D. J., Crane, F. L., Barr, R., Penel, C.和Wu, L. Y. 1988.Physiol. Plant. 72: 236-240)的抗癌药物顺销、多柔比星(阿霉素） 和EN0X2特异性苦木苦味素抑制剂glaucarubolone也抑制该重组蛋白的活性。生长惰性的 反销没有作用(表12)。
[0131] ENOXl活性需要铜的存在:铜对于ENOXl活性必不可少（图30)。当在S氣乙酸存在 下解折叠时，IEF-纯化的ENOXl在透析后和在生理抑时保留活性（图30A)。然而，若ENOXl在 =氣乙酸加铜馨合剂浴铜灵存在下解折叠，则活性丧失（图30B)。随后通过透析去除浴铜灵 并在铜存在下于生理抑时重折叠，活性恢复(图30C)。
[0132] 通过定点诱变对ABP-20基序的功能分配的确认:对于dNOX (ABP-20)的特定功能 基序通过定点诱变提供ENOX蛋白共有基序的功能分配的确认(表13)。在ENOXl蛋白共有的 CKK基序内，对于NADH氧化和蛋白二硫键-二琉基互换活性二者C44A置换中的活性减少81%。 假定腺嚷岭核巧酸结合基序中的G59A置换很大程度上消除了 NADH氧化但对二硫键-琉基互 换没有作用。生长素结合基序中的E113H置换还消除NADH氧化酶活性的生长素-刺激。假定 铜位点的置换，H106A和化52A，使NADH氧化和二硫键-琉基互换二者的活性减少至与接近背 景。
[0133] 表13 . IEF-纯化的重组ABP-20的NADH氧化酶活性和对生长素及ENOX抑制剂的响 应。3个测定的平均值±标准差
表14.通过定点诱变对dNOX (ABP-20)的功能基序的确认
术语"一个"和"一种"和"所述"W及相似的提及对象在描述本发明的情境中，特别是在 所附权利要求的情境中，解释为涵盖单数和复数二者，除非本文中另外指明或上下文明显 矛盾。本文对数值范围的叙述仅意在用作逐一提及落入范围内的每个单独值的速记方法， 除非本文另外指明，并且每个单独的数值如同其在本文中逐一列出而包括到说明书中。本 文所述的所有方法可W W任何合适的次序实施，除非本文另外指明或另外与上下文明显矛 盾。本文所提供的任何和所有实施例，或示例性语言（例如，"例如"）的使用，仅意在更好地 阐明本发明并且不构成对本发明范围的限制，除非另外要求。说明书中的任何语言均不应 解释为指示任何非-要求的要素为本发明的实践所必需的。
[0134]尽管本发明已经在附图和前述说明书中详细说明和描述，但性质上其应被认为是 说明性的而非限制性的，应理解的是仅显示和描述了优选的实施方案并且在本发明精神内 的所有变化和修饰均期需得到保护。另外，本文引用的所有参考文献指示本领域的技术水 平并且通过引用W其整体结合到本文中。
【主权项】
1. 包含编码外-烟酰胺二核苷酸氧化酶二硫键巯基互换蛋白的分离DNA的DNA构建体。2. 权利要求1的DNA构建体，其中所述DNA构建体为质粒。3. 权利要求2的DNA构建体，其中所述DNA构建体为pETl la载体。4. 权利要求3的DNA构建体，其中所述DNA序列位于pET 11 a载体的Nhe I和BamHI位点之 间。5. 权利要求1-4的DNA构建体，其中所述外-烟酰胺二核苷酸氧化酶二硫键巯基互换蛋 白为重组氧化酶二硫键巯基互换蛋白。6. 权利要求1-4的DNA构建体，其中所述外-烟酰胺二核苷酸氧化酶二硫键巯基互换蛋 白为来自智人(Homo sapiens)的哺乳动物氧化酶。7. 权利要求1-4的DNA构建体，其中所述外-烟酰胺二核苷酸氧化酶二硫键巯基互换蛋 白为来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的裂殖酵母氧化酶。8. 权利要求1-4的DNA构建体，其中所述外-烟酰胺二核苷酸氧化酶二硫键巯基互换蛋 白为来自拟南芥属(Arab i dop s i s)的高等植物氧化酶。9. 权利要求1-4的DNA构建体，其中所述外-烟酰胺二核苷酸氧化酶二硫键巯基互换蛋 白为来自李属(Prunus)的高等植物氧化酶。10. 权利要求1-4的DNA构建体，其中所述DNA序列为SEQ ID NO: 1。11. 权利要求1-4的DNA构建体，其中所述DNA序列为SEQ ID NO: 2。12. 权利要求1-4的构建体，其中所述DNA序列为SEQ ID NO: 3。13. 权利要求1-4的构建体，其中所述DNA序列为SEQ ID NO: 4。14. 包含权利要求1的构建体的细菌细胞。15. 权利要求14的细菌细胞，其中所述细菌细胞为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)物种的。16. 能够在植物中表达多肽的嵌合基因，其包含编码多肽的DNA，其中所述多肽为外-烟 酰胺二核苷酸氧化酶二硫键巯基互换蛋白。17. 权利要求16的基因，其中所述DNA编码来自智人的外-烟酰胺二核苷酸氧化酶二硫 键疏基互换蛋白。18. 权利要求16的基因，其中所述DNA编码来自拟南芥属的外-烟酰胺二核苷酸氧化酶 ^硫键疏基互换蛋白。19. 权利要求16的基因，其中所述DNA编码来自酿酒酵母的外-烟酰胺二核苷酸氧化酶 ^硫键疏基互换蛋白。20. 包含权利要求16-19中的一项的嵌合基因的微生物。21. 包含权利要求16-19中的一项的嵌合基因的植物。22. 包含权利要求16-19中的一项的嵌合基因的植物种子。23. 权利要求21的植物，其中所述植物为大豆、玉米、高粱、蔬菜、块根作物、水果或饲料 植物。24. 权利要求22的植物种子，其中所述植物种子为大豆种子、玉米种子、高粱种子、蔬菜 种子、块根作物块茎、水果种子或饲料植物种子。25. 用于增加包含权利要求16-19中的一项的嵌合基因的植物中的外-烟酰胺二核苷酸 氧化酶二硫键巯基互换蛋白的活性的方法，包括向植物中加入EN0X激活剂。26. 权利要求25的方法，其中所述ENOX激活剂为半胱氨酸。27. 权利要求25的方法，其中所述EN0X激活剂为生长素。28. 用于包含权利要求16-19中的一项的嵌合基因的转基因植物种子的种子包衣，其包 含EN0X激活剂。29. 权利要求28的种子包衣，其中所述EN0X激活剂为半胱氨酸。30. 用于栽培包含权利要求16-19中的一项的嵌合基因的植物的方法，包括作为叶面喷 洒喷雾包含半胱氨酸的组合物。31. 用于诱导包含权利要求16-19中的一项的嵌合基因的大豆作物早期开花的方法，包 括给予所述作物生长素或EN0X激活剂。32. 权利要求31的方法，其中所述EN0X激活剂为半胱氨酸。
【专利摘要】本文描述了可用于增加转基因农作物的产量的物质组合物和方法。公开了ENOX蛋白的序列信息和用于转染的方法。另外，公开了ENOX蛋白的小分子激活剂。公开了来自酵母菌酿酒酵母(<i>Saccharomyces</i><i> cerevisiae</i>)、拟南芥(<i>Aribidopsis</i><i> thaliana</i>)和桃树(<i>Prunus</i><i> persicaria</i>)的ENOX蛋白的序列信息。公开了可表现出一种或多种下列特征的转基因微生物和/或植物，所述特征包括但不限于加速成熟、细胞大小增加、站立能力增加、根和木质部发育增加以及产量增加。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82, C12N9/02, C12N15/63, C12N15/62, C12N15/53
【公开号】CN105705642
【申请号】
【发明人】D.J.莫雷, D.M.莫雷
【申请人】摩-纽克企业
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2013年6月25日