专利名称：抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域和免疫学检测领域，具体涉及一种抗拟除虫菊酯类农药SCFv的抗体基因及应用。
背景技术：
拟除虫菊酯类(Pyrethroids)农药是一类重要的仿生性杀虫剂，过去一直被认为是一种安全的农药。因其在体内具有容易被氧化酶系统降解，无蓄积性等优点，目前应用普遍、用量较大，占杀虫剂总产量的20%，占整个杀虫剂使用面积的25%。但最近有研究表明，大部分拟除虫菊酯类农药属于环境激素类物质，具有免疫系统毒性、遗传毒性和心血管毒性，严重影响哺乳类动物的正常生理活动，即使是低剂量，长期接触也容易引起慢性疾病，有些还会有致畸、致癌、致突变等作用。因此，如何有效去除农产品中该农药的残留已成为人们广泛关注的问题。因为这类农药残留物的含量极微，因此要求高度灵敏的检测技术。已报道的拟除虫菊酯类农药残留量测定方法有气相色谱(GC)法、酶联免疫吸附(ELISA)等。GC法使用高灵敏度的电子捕获检测器，因而对样品的净化要求严格，并增加了分析流程时间。这就迫切需一种新的快速检测的方法；普通的酶联免疫法虽灵敏度高、样品容量大，却存在实验动物需量大、饲养周期长，不同动物个体对农兽药敏感程度不同，造成抗体差异大等问题；单克隆抗体作为第二代抗体，由于制备和筛选过程繁琐，且对操作技术要求很高，克隆后的细胞遗传容易不稳定等原因，不利于广泛应用。基因工程抗体的优势表现在节省实验动物及饲养时间、技术简便、易于投入生产、遗传信息具有可操作性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种针对性强、稳定性高、制备方便的抗拟除虫菊酯类农药的scFv抗体及编码该抗体的基因序列。本发明的另一个目的是提供一种以拟除虫菊酯类农药为检测目标的高丰度scFv抗体库制备方法。本发明还提供了一种高效的针对拟除虫菊酯类农药为目标的scFv抗体库的筛选方法。本发明实现目的的技术方案如下:一种抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体基因的重链基因，所述重链基因的序列见序列I。一种抗拟除虫菊酯类农药SCFv的抗体基因的轻链基因，轻链基因的基因序列见序列2。一种抗拟除虫菊酯类农药SCFv的抗体基因，其包括重链基因和轻链基因，该基因由714个核苷酸组成，所述重链基因的序列见序列1，轻链基因的基因序列见序列2。
一种由抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体基因编码的抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体。而且，重链可变区由116个氨基酸组成，柔性链接区由15个氨基酸，轻链可变区由107个氨基酸组成。由scFv抗体的氨基酸序列经特换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的scFv抗体。含有抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体基因的载体。含有抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体基因的基因工程菌。抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体基因在拟除虫菊酯类农药检测及制备抗拟除虫菊酯scFv抗体中的应用。抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体基因的基因工程菌在制备抗拟除虫菊酯scFv抗体中的应用。本发明的优点和积极效果如下:本发明制备了抗拟除虫菊酯类农药的噬菌体展示的scFv抗体，基于PCR技术和噬菌体表面展示技术，本发明具有以下优点:⑴本申请通过查阅大量NCBI数据设计了兼并引物，该引物能全面地覆盖鼠源抗体重链和轻链的多样性，尤其是轻链引物 除了包括一般的kappa轻链引物，还包括了lambda轻链引物，以防止部分目的基因的丢失；⑵本发明选用杂交瘤细胞作为制备抗拟除虫菊酯类scFv抗体的基因来源，省去了免疫、饲养动物带来的繁琐，针对性更强，同时也免去了用小鼠脾脏免疫库直接淘选所带来的大量非目的抗体的干扰，减少了盲目性；⑶因为噬菌体抗体稀释液中包括一定比例的载体蛋白和封闭液成分，在淘选的亲和吸附步骤中，本申请优化了噬菌体抗体稀释缓冲液，以有利于筛选抗体更有针对性、排除载体蛋白、封闭液带来的干扰；⑷本申请的制备方法节省时间、技术简便、易于发展下游生产、遗传信息可操作且稳定。
图1:以PBA-cDNA为模板，PCR扩增抗体重链、轻链图。图中:M:DL2000核酸分子量Marker, VH:抗体重链，VL:抗体轻链。图2:用重链、轻链和柔性连接肽进行重叠延伸PCR，获得完整scFv抗体。M:DL2000核酸分子量Marker，scFv:完整单链抗体。
具体实施例方式下面结合实施例，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。为了实现本发明目的，申请人利用重组DNA技术和噬菌体展示技术，将针对拟除虫菊酯类农药具有广谱特异性的鼠源杂交瘤细胞株2G2E7的抗体重链、轻链可变区基因进行体外扩增，再经过重叠延伸PCR，用15个氨基酸(氨基酸序列(GGGGS)3，基因序列GGTGGAGGCG GTTC AGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG))组成的柔性连接肽将重链、轻链连接成scFv抗体。接着将所得的scFv基因插入到pCANTAB-5E噬菌体展示载体上，构建重组质粒并电转化至宿主菌中，得到一个细胞来源的抗体库。经过5轮固定相淘选和鉴定，获得了抗拟除虫菊酯类农药的噬菌体展示scFv抗体。其包括的重链和轻链基因序列分别如SEQ ID N0.1和 SEQ ID N0.2。本发明还提供了 scFv重链、轻链的氨基酸序列如序列18和序列19。本发明还提供了借助NCBI设计的兼并引物，用于扩增上述基因。其中轻链扩增引物除了常用的kappa链引物还引入了 lambda链引物，以覆盖抗体可变区的多样性。本发明还提供了含有上述基因的载体和载体的宿主细胞。本发明还提供了上述scFv抗体、编码该抗体的基因、含有该基因的载体、含有该载体的宿主细胞在制备抗拟除虫菊酯类农药scFv抗体中的应用。本发明还提供了淘选抗体库时，处理噬菌体抗体所用的、经优化的去干扰化处理液，以增强淘选的针对性。以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中使用的试剂材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。以下实施例中由于拟除虫菊酯类农药通用半抗原在合成时简称为PBA，所以以下相应细胞、基因、菌种等提到有 关拟除虫菊酯类农药时均简称为PBA。实施例1PBA单克隆细胞总RNA的提取及cDNA的合成1、PBA单克隆细胞株2G2E7总RNA的提取取通过本实验室筛选得到的新鲜单克隆细胞株2G2E7,利用Qigen Rneasy MiniKit提总RNA，细胞株2G2E7可产生抗PBA的单克隆抗体。⑴培养细胞至3-4X IO6个，300 Xg离心5min，移去上清；⑵配制裂解液=Buffer RLT: β-巯基乙醇=Iml: 10 μ I ；⑶向离心后的细胞中加入350μ I Buffer RLT裂解缓冲液，轻弹管壁，用移液枪吹打，使缓冲液与细胞充分接触；⑷加入同等体积的70%的乙醇溶液，移液枪轻轻吸打混匀，注意不要离心；(5)取Qigen Rneasy Mini Kit中的娃胶柱,装入2ml收集管上,转移所有的样品到柱子中，室温下12000rpm离心15s,弃去废液；(6)加入700 μ I Buffer Rffl到柱中，室温下12000rpm离心15s，弃去流出液；(7)加入500 μ I用乙醇稀释的RPE缓冲液，洗涤柱子，IOOOOrpm,离心15s，弃上清；(8)加入500 μ I RPE缓冲液移入柱子，轻盖盖子，室温下lOOOOrpm，离心2min，冲洗
柱子;⑶把柱子放入一个试剂盒提供的新2ml收集管中，全速离心Imin ；(10)把柱子转移至Ij Qigen Rneasy Mini Kit提供的1.5ml离心管中，取50 μ I的无RNA酶水(试剂盒提供)小心悬空滴加到柱子的膜上，静置3-5min，轻轻盖上盖子，室温下IOOOOrpm 离心 lmin，洗脱 RNA ；(11)洗脱的RNA分装、标记后，冻存于_80°C。2、PBA-cDNA 的合成⑴添加以下组分到1.5ml离心管:
权利要求
1.种抗拟除虫菊酯类农药SCFv的抗体基因的重链基因，其特征在于:所述重链基因的序列见序列I。
2.种抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体基因的轻链基因，其特征在于:轻链基因的基因序列见序列2。
3.种抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体基因，其特征在于:其包括重链基因和轻链基因，该基因由714个核苷酸组成，所述重链基因的序列见序列1，轻链基因的基因序列见序列2。
4.权利要求3所述基因编码的抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体。
5.据权利要求4所述的抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体，其特征在于:重链可变区由116个氨基酸组成，柔性链接区由15个氨基酸，轻链可变区由107个氨基酸组成。
6.权利要求4所述scFv抗体的氨基酸序列经特换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的scFv抗体。
7.有权利要求3所述的抗体基因的载体。
8.有权利要求3所述的抗体基因的基因工程菌。
9.利要求1、2或3所述的任一项基因在拟除虫菊酯类农药检测及制备抗拟除虫菊酯scFv抗体中的应用。
10.利要求7所述的载体或权利要求8所述的基因工程菌在制备抗拟除虫菊酯scFv抗体中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种抗拟除虫菊酯类农药scFv的抗体基因，涉及拟除虫菊酯类农药抗体库的构建、特异性单链抗体基因的筛选、特异性单链抗体基因的序列测定、特异性噬菌体展示单链抗体的制备，该抗体基因包含编码重链可变区(116个氨基酸)、柔性链接区(15个氨基酸)和轻链可变区(107个氨基酸)的核苷酸序列，如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，并利用噬菌粒在宿主细胞中制备了展示在噬菌体表面形式的该抗体。而且该抗体能在噬菌体表面正常表达和折叠，能够较好的地识别拟除虫菊酯类抗原。本发明与传统抗体相比较，该抗体具有稳定性高、制备方便等优势，具有重要的潜在应用价值。
文档编号C12N1/15GK103088033SQ20131002981
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者杜欣军, 常继晨, 王硕 申请人:天津科技大学