专利名称：冬瓜熟腌过程中的优势菌群及其扩增引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群及其扩增引物。
背景技术：
腌冬瓜(即臭冬瓜)是浙东地区传统的特色腌制蔬菜食品之一，其历史渊源深远；臭冬瓜具有臭味，但入口易化、口味独特，是浙江宁绍等地区人们十分喜爱的佐餐佳品。冬瓜的熟腌按传统熟腌工艺进行，将新鲜的冬瓜清洗干净后，称重、去皮、去子瓤。然后切成边长8cm左右的方块，放入沸水中煮至6 8分熟，捞出。将捞出的冬瓜在清水中浸泡一天，然后按照一定比例加入食盐，加盐的时候要将冬瓜块的六个面都抹上食盐，以面对面、背对背的方式放入坛中，最后用塑料纸封口，放于阴凉处发酵20天即可。目前冬瓜的熟腌加工方式还是以传统的自然发酵工艺为主，大多数加工企业对产品质量的控制是通过技术人员长期生产所积累的经验来判断和控制，而且产品的质量受外界因素(温度、湿度、PH等)的影响非常明显，这难于维持产品质量(如风味、营养等)的稳定性，更谈不上实现标准化生产。很多研究表明，在蔬菜腌制过程中，微生物的菌群结构以及各种微生物的数量在腌制过程中的变化在腌制过程中起到非常重要的作用。首先，这些微生物代谢产生的有机酸及其他代谢产物对产品特殊风味的形成起到了重要的作用；其次，有机酸等微生物的代谢产物能够抑制腐败微生物的生长，对产品的保藏起到了决定性作用。由于传统的纯培养技术研究微生物多样性的局限性和片面性，很难准确了解冬瓜腌制过程中微生物种群结构以及不同微生物的作用，给腌制工艺的改进也带来盲目性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群及其扩增引物，该扩增引物可用于定量检测优势菌群的数量，从而为产品的工艺优化和品质控制提供依据。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群，在冬瓜熟腌的初期，腌制体系中的优势菌为不动杆菌属、魏斯氏菌属和芽孢杆菌属；在冬瓜熟腌的早期，优势菌则转变为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属；在冬瓜熟腌的中期，优势菌属变为乳杆菌属、芽孢杆菌属和魏斯氏菌属；在冬瓜熟腌的后期，优势菌为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属。所述的初期为冬瓜熟腌的第0-5天，所述的早期为冬瓜熟腌的第6-10天，所述的中期为冬瓜熟腌的第11-15天，所述的后期为冬瓜熟腌的第16-20天。—种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，所述的优势菌为所述的肠杆菌属的类肠膜明串珠菌 ，所述的类肠膜明串珠菌的上游引物为5' -GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA-3'，下游引物为 5' -AACCATGCGGTTGTTGGTA-3'。所述的类肠膜明串珠菌的荧光定量PCR反应条件为预变性95°C保持2分钟，然后40 个循环:95°C 15s，57°C 20s, 72°C 20s。一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，所述的优势菌为所述的不动杆菌属的醋酸钙不动杆菌，所述的醋酸钙不动杆菌的上游引物为5'-GGAGAGAGGTAGCTTGCTACTGATC -3'，下游引物为 5' - AACTAAAGTAGCCTCCTCCTCGC -3'。所述的醋酸钙不动杆菌的荧光定量PCR反应条件为预变性95°C保持2分钟，然后40 个循环:95°C 15s，60°C 20s, 72°C 20s。一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，所述的优势菌为所述的魏斯氏菌属的食窦魏斯氏菌，所述的食窦魏斯氏菌的上游引物为5' - GAGTAACTGTTCAGTGTGTGACGG-3'，下游引物为 5' - TCATCCAGTTTCCAAAGCCAT -3'。所述的食窦魏斯氏菌的荧光定量PCR反应条件为预变性95°C保持2分钟，然后40个循环:95°C 15s，60°C 20s, 72°C 20s。一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，所述的优势菌为所述的乳杆菌属的弯曲乳杆菌，所述的弯曲乳杆菌的上游引物为Y - GAACGCACTCTCGTTAGATTG ，下游引物为 5' - CAAATGTTATCCCCCACTTTAG -3'。所述的弯曲乳杆菌的荧光定量PCR反应条件为预变性95°C保持2分钟，然后40个循环:95°C 15s，57°C 20s, 72°C 15s。与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明首次公开了冬瓜熟腌过程中的优势菌群及其扩增引物，依据冬瓜腌制过程中的优势微生物的序列，设计特异性的引物，利用SYBR Green I作为荧光染液，对冬瓜腌制过程中的优势菌在各个腌制阶段的数量进行了检测分析，实验结果可以为产品的工艺优化和品质控制提供依据。冬瓜腌制加工中产品质地、风味和营养等品质与存在的微生物种群、数量等密切相关，因此了解蔬菜腌制过程中的微生态结构以及数量变化，揭示冬瓜发酵过程中的优势微生物的动态变化情况，从而为工艺改进及品质控制提供理论依据。
图1为类肠膜明串珠菌的定量标准曲线 图2为醋酸钙不动杆菌的定量标准曲线 图3为食窦魏斯氏菌的定量标准曲线 图4为弯曲乳杆菌的定量标准曲线 图5为类肠膜明串珠菌特异性引物电泳图；M:maker，l:类肠膜明串珠菌(魏斯氏菌属)，2:醋酸钙不动杆菌(不动杆菌属)，3:食窦魏斯氏菌(魏斯氏菌属)，4:弯曲乳杆菌(乳杆菌属)，5:盐脱氮芽孢杆菌(芽孢杆菌属)，6:产气肠杆菌(肠杆菌属)，7:金黄色葡萄球菌(葡萄球菌属)；
图6为醋酸钙不动杆菌特异性引物电泳图；M:maker，l:醋酸钙不动杆菌(不动杆菌属)，2:类肠膜明串珠菌(魏斯氏菌属)，3:食窦魏斯氏菌(魏斯氏菌属)，4:弯曲乳杆菌(乳杆菌属)，5:盐脱氮芽孢杆菌(芽孢杆菌属)，6:产气肠杆菌(肠杆菌属)
7:金黄色葡萄球菌(葡萄球菌属)；
图7为食窦魏斯氏菌特异性引物电泳图； M:maker, 1:食窦魏斯氏菌(魏斯氏菌属)，2:醋酸钙不动杆菌(不动杆菌属)，3:类肠膜明串珠菌(魏斯氏菌属)，4:弯曲乳杆菌(乳杆菌属)，5:盐脱氮芽孢杆菌(芽孢杆菌属)，6:产气肠杆菌(肠杆菌属)7:金黄色葡萄球菌(葡萄球菌属)；
图8为弯曲乳杆圃特异性引物电泳图；M:maker, 1:弯曲乳杆圃(乳杆圃属)，2:食棄魏斯氏菌(魏斯氏菌属)，3:醋酸钙不动杆菌(不动杆菌属)，4:类肠膜明串珠菌(魏斯氏菌属)，
5:盐脱氮芽孢杆菌(芽孢杆菌属),6:产气肠杆菌(肠杆菌属),7:金黄色葡萄球菌(葡萄球菌属)。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。一、具体实施例1
本发明一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群，在冬瓜熟腌的初期，腌制体系中的优势菌为不动杆菌属、魏斯氏菌属和芽孢杆菌属；在冬瓜熟腌的早期，优势菌则转变为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属；在冬瓜熟腌的中期，优势菌属变为乳杆菌属、芽孢杆菌属和魏斯氏菌属；在冬瓜熟腌的后期，优势菌为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属。确定优势菌群的具体过程如下:
1、冬瓜熟腌
冬瓜的熟腌按传统熟腌工艺进行。将新鲜的冬瓜清洗干净后，称重、去皮、去子瓤。然后切成边长8 cm左右的方块，放入沸水中煮至6 8分熟，捞出。将捞出的冬瓜在清水中浸泡一天，然后按照12.5千克冬瓜加0.8千克食盐的比例加入食盐，加盐的时候要将冬瓜块的六个面都抹上食盐，以面对面、背对背的方式放入坛中。最后用塑料纸封口，放于阴凉处发酵20天即可。
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2、样品总DNA提取纯化
采用Fast DNA SPIN Kit试剂盒(MP Biomedicals，美国)，按说明书上步骤，分别取熟腌冬瓜O天、5天、10天、15天、20天的腌制冬瓜卤水样品50ml进行总DNA的提取,提取过程如下:
(1)取冬瓜腌制卤水样品约200mL，记为样品1-5，无菌纱布过滤后，lOOOOrpm，4°C离心5min,弃上清,浙干；
(2)在管中加入978ul磷酸盐缓冲液和122ul MT缓冲液；
(3)用混凝器震荡混勻10min, 12000rpm离心Imin ；
(4)取上清液到干净的1.5ml的离心管中，加入250ul pps缓冲液至上清液中反复用手颠倒10次左右进行混匀后，1200rpm离心5min ；
(5)将上清液转移到两个干净的离心管中，在每管中加入45ml混匀的bindingMattix,反复颠倒,持续混勻2 min ；
(6)取步骤(5)得到的混合物600ul，转移至IjSpin Filter中，10000 rpm离心Imin,倒掉下层液体，把剩余混合物依旧加入Spin Filter中，再次10000 rpm,离心Imin,直到混合物离心完为止；
(7)加入500ulSEWS-M溶液到Spin Filter，用枪头轻轻吹打使其悬浮，12000rpm离心Imin,去除滤液，12000rpm离心2min,弃去Catch Tube (用于旋转过滤用的试管),换一个干净的Catch Tube室温干燥5min ；(8)在CatchTube中加入120ul DES并混匀，55°C水浴5min，水浴2_3min时轻轻吹打一次，以此来提高DNA的洗脱率；
(9)水浴后,将CatchTubel2000rpm离心Imin,收集到的滤液即为样品DNA ;
(10)在1%的琼脂糖凝胶电泳检测，-20°C冷藏备用。3、PCR 扩增
PCR 扩增所用的反应体系为:10XBuffer 5μ L.25 mmol/L 的 MgCl25 μ L、2.5mmol/L的dNTP8yL、10ymol/L的生腌冬瓜总DNA PCR扩增上下游引物各1.0 μ L，具体为27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ')和 1492R (5 ' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 ')、模板DNA1.0 μ L、5U/ μ L的Εχ-T^DNA聚合酶0.4 μ L，用灭菌双蒸水补足50 μ L体系。PCR反应的循环条件为95°C预变性3min，30个循环(94°C变性50s，52°C退火50s，72°C延伸lmin30s)，72°C最后延伸lOmin。PCR产物采用纯化试剂盒切胶纯化。4、PCR产物的纯化
UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收DNA目的片段步骤:
(1)通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块， 放入1.5mL离心管中。判定DNA片段位置时，要尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短。切胶时应尽可能减少胶的体积；
(2)称量凝胶的重量，以Img=Iμ L换算凝胶的体积。每IOOmg凝胶中加入300 μ LBinding Buffer II ；
(3)置于50-60°C水浴中lOmin，使胶彻底融化。加热融胶时，每2min混匀一次。(当所要回收的DNA片段小于500bp时，需要在溶胶后，另外再加入2倍胶体积的100%的异丙醇混匀)；
(4)将融化的胶溶液转移到套放在2mL收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，12000rpm室温离心lmin。(如果溶胶后的总体积大于700 μ L，可以加样2次以上进行分别离心。)
(5)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500 μ L Wash Solution, 12000rpm 室温离心 lmin ；
(6)重复步骤5—次；
(7)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000rpm室温离心lmin。(将离心后的UNIQ-10柱放入恒温箱中50°C干燥5min，或自然晾干lOmin，有助于酒精的挥发，提高DNA的洗脱效率)
(8)将UNIQ-10柱放入一根新的1.5mL离心管中，在柱子膜中央加40 μ L ElutionBuffer(洗脱液)放置 5min。(将 Elution Buffer 加热到 60°C或者直接将 Elution Buffer加入到UNIQ-10柱中后60°C温育5min，有助于提高DNA的洗脱效率；也可以用双蒸水，用IM的NaOH将pH调节到8.5后，再60°C洗脱)
(9)12000rpm室温离心lmin,离心管中的液体即为回收的DNA片段,可立即使用或保存于-20°C备用。5、连接转化
将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体试剂盒(大连宝生物公司，产品货号:D101A)在4°C过夜连接，连接体系如下所示，pMD18-T vector:0.5PL ;Solution 1:2.5PL;PCR 回收产物:2PL。然后转化感受态细胞疋coli DH5a中，涂板。转化过程如下:
(I)将连接产物吸到IOOPL感受态细胞中，温和混匀，置于冰上30min。(2)42°C热休克90s，迅速放回冰中，将细胞冷却l_2min后，加入800μ LB培养基，370C、125rpm 振荡培养细菌 45_90min。(3) 4000rpm离心lmin，沉淀菌体，吸去上清液，留250μ 左右转化混合物铺于LB (Amp+)琼脂平板上，室温下放置20-30min，待溶液完全被琼脂吸收后，倒置平皿37°C培养
12-16h。(4)随机挑取单菌落作PCR进行初步检测，并振荡培养。6、转化子的筛选
对转化子的筛选采用了蓝白斑及PCR的方法，PCR直接以白斑菌落为模板，采用能与T-载体插入点两侧特异结合的M13通用引物进行检测。PCR 扩增采用引物为:M13+(5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 ’)及 M13_(5’ -AGCGGATAACAATTTCACACGA-3’ ) (M13 通用引物为现有技术)。PCR 反应体系为:10 X PCR Buffer 2.5 μ L, dNTP (2.5mmol/L) 1.5 μ L，正向引物(10ymol/L)0.5μ L,反向引物(10 μ mol/L) 0.5 μ L, DNA 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L,MgCl2 (25mmol/L) 2.5 μ L，模板DNA 1.0 μ L，用超纯水补足反应总体积至25 μ L。PCR扩增反应程序为:94 °C预变性5min，32个循环(94 V变性50s，56 °C退火50s, 72°C延伸lmin20s)，72°C最终延伸10 min。扩增完毕后，于1%的琼脂糖凝胶上电泳。7、基因序列的鉴别
测序结果采用DAMBE、DNAstar, MEGA4.1等软件进行编辑分析，并把编辑好的序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，分析出克隆所属物种的系统位置和与之最近似的种类，即得到冬瓜熟腌过程中各个阶段的优势菌群。8、冬瓜熟腌体系腌制过程中优势菌群的分析
将来自冬瓜熟腌体系不同腌制过程中 阳性克隆子的测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对，检测出腌制过程中共涉及到9个不同的菌属，其中以不动杆菌属、乳杆菌属和魏斯氏菌属的变化最为明显。5个时期的克隆子与GenBank数据库中已知细菌的16SrDNA序列相似性范围在90%以上；冬瓜熟腌体系中不同腌制时期样品的细菌群落测定结果如表I所示。表I 16S rDNA克隆文库法对腌制冬瓜样品的细菌群落组成分析结果
权利要求
1.一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群，其特征在于:在冬瓜熟腌的初期，腌制体系中的优势菌为不动杆菌属、魏斯氏菌属和芽孢杆菌属；在冬瓜熟腌的早期，优势菌则转变为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属；在冬瓜熟腌的中期，优势菌属变为乳杆菌属、芽孢杆菌属和魏斯氏菌属；在冬瓜熟腌的后期，优势菌为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属。
2.根据权利要求1所述的一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群，其特征在于:所述的初期为冬瓜熟腌的第0-5天，所述的早期为冬瓜熟腌的第6-10天，所述的中期为冬瓜熟腌的第11-15天，所述的后期为冬瓜熟腌的第16-20天。
3.一种根据权利要求1所述的冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，其特征在于:所述的优势菌为所述的肠杆菌属的类肠膜明串珠菌，所述的类肠膜明串珠菌的上游引物为5' -GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA-3'，下游引物为 5' -AACCATGCGGTTGTTGGTA-3'。
4.根据权利要求3所述的一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，其特征在于:所述的类肠膜明串珠菌的荧光定量PCR反应条件为预变性95°C保持2分钟，然后40个循环:95°C 15s，57°C 20s, 7 2°C 20s。
5.一种根据权利要求1所述的冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，其特征在于:所述的优势菌为所述的不动杆菌属的醋酸钙不动杆菌，所述的醋酸钙不动杆菌的上游引物为 5' - GGAGAGAGGTAGCTTGCTACTGATC -3'，下游引物为 5' - AACTAAAGTAGCCTCCTCCTCGC_3' ο
6.根据权利要求5所述的一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，其特征在于:所述的醋酸钙不动杆菌的荧光定量PCR反应条件为预变性95°C保持2分钟，然后40个循环:95°C 15s，60°C 20s, 72°C 20s。
7.一种根据权利要求1所述的冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，其特征在于:所述的优势菌为所述的魏斯氏菌属的食窦魏斯氏菌，所述的食窦魏斯氏菌的上游引物为5' - GAGTAACTGTTCAGTGTGTGACGG -3'，下游引物为 5' - TCATCCAGTTTCCAMGCCAT -3'。
8.根据权利要求7所述的一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，其特征在于:所述的食窦魏斯氏菌的荧光定量PCR反应条件为预变性95°C保持2分钟，然后40个循环:950C 15s,60°C 20s, 72°C 20s。
9.一种根据权利要求1所述的冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，其特征在于:所述的优势菌为所述的乳杆菌属的弯曲乳杆菌，所述的弯曲乳杆菌的上游引物为5,-GAACGCACTCTCGTTAGATTG -3'，下游引物为 5' - CAAATGTTATCCCCCACTTTAG -3'。
10.根据权利要求9所述的一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，其特征在于:所述的弯曲乳杆菌的荧光定量PCR反应条件为预变性95°C保持2分钟，然后40个循环:950C 15s,57°C 20s, 72°C 15s。
全文摘要
本发明公开了冬瓜熟腌过程中的优势菌群及其扩增引物，在冬瓜熟腌的初期，腌制体系中的优势菌为不动杆菌属、魏斯氏菌属和芽孢杆菌属；早期为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属；中期为乳杆菌属、芽孢杆菌属和魏斯氏菌属；后期为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属，其中类肠膜明串珠菌的上下游引物如SEQIDNO.1和NO.2所示，醋酸钙不动杆菌的上下游引物如SEQIDNO.3和NO.4所示，食窦魏斯氏菌的上下游引物如SEQIDNO.5和NO.6所示，弯曲乳杆菌的上下游引物如SEQIDNO.7和NO.8所示，优点是揭示冬瓜发酵过程中的优势微生物动态变化情况，从而为工艺改进及品质控制提供理论依据。
文档编号C12N1/20GK103114058SQ20131002962
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月24日 优先权日2013年1月24日
发明者沈锡权, 赵永威, 吴祖芳, 翁佩芳 申请人:宁波大学