专利名称：一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨的制作方法
技术领域：
本发明属于植物品种改良的生物技术，具体地涉及一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨。
背景技术：
杨树是世界上分布最广，适应性最强的树种，是我国重要的速生用材树种之一。然而，随着环境的不断恶化，自然灾害的频繁发生，食叶害虫和蛀干害虫的危害成为大面积发展杨树丰产林的最大障碍，化学防治方法不仅成本高、污染环境，而且易使害虫产生抗药性，因此，利用基因工程方法培育具有抗虫能力的杨树新品种是控制虫害的重要途径。林木植物由于生长周期较长，总是面临周围环境中各种病虫害的侵犯，因此在长期的演化过程中，他们自身已获得了适度、有效的生物抗性机制，能够最大限度地避免逆境的危害。通过深入挖掘并利用林木植物这种自身的病虫害防御机制，利用基因工程方法培育转基因抗虫林木新品种，对发展生态林业、保护生态环境具有重要意义。WIN4是一种杨树叶片创伤后诱导表达的蛋白，目前仅被描述为一种营养储存蛋白，尚无文献资料报道其对杨树主要食叶害虫之一——鳞翅目杨尺蠖具有抗虫能力。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨。本发明的技术方案概 述如下:一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨，是用下述方法获得:(I)以杂交杨(Populus trichocarpaXPopulus deltoides)叶片的总 RNA 为模板，以SEQID N0.2、SEQ ID N0.3所示核苷酸序列为上、下游引物，通过RT-PCR得到了 SEQID N0.1表示的核苷酸序列；(2)将凝胶回收的SEQ ID N0.1表示的核苷酸序列连接到pJETl.2载体上得到重组质粒并导入E.coli菌株T0P10，筛选出阳性克隆，提取质粒；(3)将步骤(2)获得的质粒双酶切，将凝胶回收的SEQ ID N0.1表示的核苷酸序列与经双酶切的植物表达载体PBI121进行连接，转化E.coli菌株T0P10 ；(4)用SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3筛选含有抗性质粒的菌落，提取质粒并进行质粒PCR验证、BamHI/SacI双酶切验证，挑选正确的重组子，将其命名为pBI121WIN4 ；(5)将PBI121-WIN4通过电击法转入根癌农杆菌C58中，得到的菌落进行菌落PCR鉴定，大小为981bp片段的菌落即为正确的菌株；(6)将步骤(5)获得的菌株转化欧美杂交杨(Populus deltoides X Populusnigra),获得一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨。本发明将杂交杨(PopulustrichocarpaXPopulus del toides)中编码创伤应答蛋白WIN4的基因导入欧美杂交杨(Populus deltoidesXPopulus nigra)中得到一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨(转基因杂交杨)，利用转基因杂交杨和非转基因欧美杂交杨(Populus deltoidesXPopulus nigra)(对照植物)的叶片分别饲喂杨尺蠖，结果证明，本发明的转基因杂交杨对杨尺蠖幼虫的致死率显著优于对照植物；转基因杂交杨对杨尺蠖幼虫生长发育的负面影响显著高于对照植物；转基因杂交杨对杨尺蠖成虫的化蛹率、羽化率、产卵量和卵孵化率的负面影响均显著高于对照植物。本发明通过将创伤应答蛋白WIN4基因遗传转化重要林木植物欧美杂交杨以提高其抗虫能力，利用该方法能够显著提高欧美杂交杨对我国杨树主要食叶害虫之一——鳞翅目杨尺蠖的抗虫能力，为培育抗虫林木提供了一种十分有效的方法，对降低农药使用、延缓害虫抗性的产生具有一定的意义，对维持生态系统的平衡和可持续发展也有重大的应用价值。
图1 为来源于杂交杨(Populus trichocarpaXPopulus deltoides)的创伤应答蛋白基因cDNA的克隆。图2为携带创伤应答蛋白基因WIN4的植物表达载体图。图3为转基因杂交杨基因组DNA的PCR检测。图4为转基因杂交杨的RT-PCR检测。
具体实施例方式下述结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1:转基因杂交杨的获得1、杂交杨(Populus trichocarpa 母本 XPopulus del toides 父本)创伤应答蛋白基因cDNA的克隆根据Genbank 登录的杂交杨(Populus trichocarpaXPopulus deltoides)创伤应答蛋白的部分cDNA序列(L20233.1),设计引物，以杂交杨(PopulustrichocarpaXPopulusdel toides)叶片总 RNA 为模板，以 Forward:5，-atgtcgagcgttaacttggtag-3，；(SEQ ID N0.2)和 Reverse:5，_tcattcacaagccaaacgtg_3，；(SEQ ID N0.3)为上、下游引物，通过RT-PCR得到了预期大小的特异条带(SEQ IDN0.1表示的核苷酸序列)，结果如图1所示。凝胶回收PCR产物(SEQ ID N0.1表示的核苷酸序列)，并将回收的PCR产物连接到PJET1.2载体上，将连接产物导入E.coli菌株T0P10 ;并筛选出阳性克隆，测序后利用DNAMAN进行氨基酸预测，并与Genbank中预测蛋白氨基酸序列(GenBank:AAA16342.1)比较，结果完全一致，表明克隆的序列正确，为杂交杨(Populustrichocarpa X Populusde I to ides)损伤应答蛋白基因 cDNA。2、植物表达载体的构建
将上述阳性克隆单菌落提取质粒(WIN4重组到测序载体pJETl.2后构建的质粒)经BamHI/SacI双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收981bp的片段，植物表达载体pBI121经BamHI/SacI双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收载体大片段。将回收的2种片段连接后转化E.coli菌株T0P10，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上用SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3筛选含有抗性质粒的菌落。对筛选出的单菌落提取质粒，并对质粒用WIN4目的基因的特异性引物(SEQ IDN0.2, SEQ ID N0.3)进行PCR验证、BamHI/SacI双酶切验证，挑选正确的重组子，将其命名为PBI121-WIN4，载体图谱如图2所示。3、农杆菌工程菌株的制备将上述获得的植物表达载体pBI121-WIN4通过电击法转入根癌农杆菌C58中，在含有利福平和卡那霉素各50mg/L的YEB固体培养基上涂板，得到的菌落进行菌落PCR鉴定，得到大小为981bp片段的菌落即为正确的菌株。将该菌株的单菌落接种到新鲜YEB培养基(含利福平和卡那霉素各50mg/L)中，28°C 180rpm震荡培养至0D_大约为0.5时制得用于转化的菌液。4、农杆菌介导的杨树遗传转化在超净工作台上，将欧美杂交杨(Populusdeltoides XPopulus nigra)2_3cm 长的茎段放入上述菌液中浸泡lOmin ，之后将茎段转移到共培养培养基中于23°C暗培养3天。之后将茎段转入附加20mg/L卡那霉素的筛选培养基中，于23°C培养I个月后出现愈伤组织。将带有抗性愈伤组织的茎段转接于分化筛选培养基，大约I个月后可观察到不定芽。待不定芽长至2-3cm时沿其基部剪下，转移到生根筛选培养基，3-4周根系发育完全，获得一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨(转基因杂交杨)。5、转基因杂交杨的分子检测(I)基因组DNA的PCR鉴定用Takara 公司的 Universal genomic DNA extraction kit 提取转基因杂交杨叶片的基因组DNA，以该DNA为模板，用目的基因的特异性引物(SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3)对其进行PCR。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，M:DNA marker ；1:非转基因欧美杂交杨(Populus deltoides XPopulus nigra)(阴性对照)；2_6:转基因杂交杨；7:pBI121-WIN4质粒(阳性对照)。从图中可以看出，转基因杂交杨和阳性对照均能扩增得到981bp的特异性条带，证明WIN4已经整合进杨树基因组中。(2) RT-PCR 检测用QIAGEN公司的RNeasy mini kit提取转基因杂交杨叶片的总RNA，以该RNA为模板进行cDNA合成(iScript cDNA Synthesis kit, BioRad),用目的基因的特异性引物(SEQID N0.2,SEQ ID N0.3)对反转录产物进行RT-PCR分析。结果如图4所示，M:DNA marker ；1-6:转基因杂交杨。从图中可以看出，转基因杂交杨均能扩增得到981bp的特异性条带，证明WIN4已经在转基因杂交杨叶片中表达。共培养培养基包括:MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ipl.02mg, pH=5.7,乙酰丁香酮 19.86mg,琼脂 7.2g，加水至 1L。筛选培养基包括:MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ0.05mg, pH=5.7，头孢霉素350mg,卡那霉素20mg,琼脂7.2g,加水至1L。分化筛选培养基包括:MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ0.0022mg, pH=5.7，头孢霉素350mg,卡那霉素20mg,琼脂7.2g,加水至1L。生根筛选培养基包括:MS盐2.2g，蔗糖30g，pH=5.7，头孢霉素350mg，卡那霉素20mg，琼脂7.2g，加水至IL0实施例2:—种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨(转基因杂交杨)对杨尺蠖害虫的抗虫能力研究1、杨尺蠖的群体饲养在室内常温条件下孵化杨尺蠖卵块，将刚孵化的杨尺蠖I龄幼虫放在清洁干燥的罐头瓶中，用转基因杂交杨和非转基因欧美杂交杨(Populus deltoides XPopulus nigra)(对照植物)的叶片分别喂饲幼虫，用透气纱布扎紧瓶口，保证叶片新鲜、充足。每瓶30只幼虫，设6个重复。将培养瓶置于(25±2) °C，相对湿度(RH) 70%-80%的生化培养箱中培养。饲养3周时统计各处理杨尺蠖幼虫的体重和体长；化蛹前统计存活情况，计算死亡率；记录每次饲喂叶片重量和剩余叶片重量，计算与对照相比的取食量；化蛹后统计化蛹率和平均蛹重；羽化后统计羽化、产卵量和孵化情况。2、转基因杂交杨对杨尺蠖的抗虫性分析(I)转基因杂交杨对杨尺蠖幼虫生长发育的影响分别用不同株系的转基因杂交杨和非转基因欧美杂交杨(Populusdeltoides XPopulusnigra)(对照植物)叶片饲养杨尺蠖初孵幼虫，饲养3周时统计各处理杨尺蠖幼虫的体重和体长,饲喂对照植物的幼虫平均体重为292.6mg，平均体长2.9cm,化蛹后的平均蛹重为176.3mg，而饲喂转基因杂交杨的幼虫平均体重和体长及蛹重均显著降低，说明转基因杂交杨对杨尺蠖幼虫的生长发育影响高于对照植物。化蛹前饲喂对照植物使杨尺蠖幼虫的总死亡率为3.0%，而饲喂转基因杂交杨使幼虫的总死亡率显著提高达18.1%-22.0%，表明转基因杂交杨对杨尺蠖幼虫的致死作用高于对照植物。结果见表I。表I转基因杂交杨和对照植物对杨尺蠖幼虫生长发育的影响
权利要求
1.一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨，其特征是用下述方法获得: (1)以杂交杨(PopulustrichocarpaXPopulus deltoides)叶片的总 RNA 为模板，以SEQID N0.2,SEQ ID N0.3所示核苷酸序列为上、下游引物，通过RT-PCR得到了 SEQ ID N0.1表示的核苷酸序列； (2)将凝胶回收的 SEQID N0.1表示的核苷酸序列连接到pJETl.2载体上得到重组质粒并导入E.coli菌株T0P10，筛选出阳性克隆，提取质粒； (3)将步骤(2)获得的质粒双酶切，将凝胶回收的SEQID N0.1表示的核苷酸序列与经双酶切的植物表达载体PBI121进行连接，转化E.coli菌株TOPlO ； (4)用SEQID N0.2,SEQ ID N0.3筛选含有抗性质粒的菌落，提取质粒并进行质粒PCR验证、BamHI/SacI双酶切验证，挑选正确的重组子，将其命名为pBI121_WIN4 ； (5)将pBI121-WIN4通过电击法转入根癌农杆菌C58中，得到的菌落进行菌落PCR鉴定，大小为981bp片段的菌落即为正确的菌株； (6)将步骤(5)获得的菌株转化欧美杂交杨(PopulusdeltoidesXPopulus nigra),获得一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨。
全文摘要
本发明公开了一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨，用下述方法获得以杂交杨(Populus trichocarpa×Populus deltoides)叶片的总RNA为模板，以SEQ ID No.2、3为引物，RT-PCR得到SEQ ID No.1并连接到pJET1.2上得到重组质粒并导入E.coli菌株TOP10，筛选阳性克隆，筛选含有抗性质粒的菌落，提取质粒进行PCR验证、双酶切验证，挑选正确的重组子，命名为pBI121-WIN4并转入根癌农杆菌，进行菌落PCR鉴定；获得的菌株转化欧美杂交杨，得到抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨。本发明的抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨对杨尺蠖害虫的抗虫能力强。
文档编号C12N15/84GK103088057SQ20131002955
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者王洁华, 杨少辉, 宋英今 申请人:天津大学