专利名称：一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于同源重组原理的无标记基因敲除方法和基于￠-半乳糖苷酶活性的双交换子菌落筛选方法，尤其涉及一种高效筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans)无标记基因敲除菌株的方法。
背景技术：
嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans,简称A.thiooxidans)是一种极端嗜酸性、革兰氏阴性、专性化能自养细菌，能利用各种还原性或部分还原性无机硫化物(RISCs)获得生长繁殖所需的能量，通过卡尔文循环固定空气中的CO2作为主要碳源。在细菌冶金、煤的脱硫等方面发挥了重要作用，作为一种重要的浸矿微生物，与嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidans)联合浸矿能显著提高后者对硫化矿的浸出效率。但是由于A.thiooxidans的营养类型为专性化能自养菌，具有生长缓慢、代时长和细胞得率低的特点，且对矿物中所含的某些重金属离子缺乏抗性，不仅限制了 A.thiooxidans的基础研究，而且限制了 A.thiooxidans的实际应用。为了深入研究A.thiooxidans的基因功能、代谢途径及其各种抗逆机制，构建高效浸矿工程菌，提高A.thiooxidans的应用效能，必须使用分子生物学方法对其进行遗传改造，因此，构建能对A.thiooxidans进行稳定遗传改造的体系是当下亟待解决的问题。发明人的实验室在国际上率先在A.thiooxidans中建立了基于接合转移原理的遗传转移系统，将具有接合转移功能的广泛宿主范围质粒从大肠杆菌中转入A.thiooxidans中(Jin SM, YanWM and Wang ZN,Appl.Environ.Microbiol., 1992, Vol.58.N0.1, 429-430),并成功实现了外源基因在A.thiooxidans中的异源表达,提高了 A.thiooxidans外源有机质的利用能力(Tian, KL, Lin JQ, Liu XM, Liu Y，Zhang CK and Yan WM, Biotechnol.Lett., 2003, Vol.25, N0.10, 749-754)。但是以质粒形式携带外源基因在A.thiooxidans中进行表达的遗传改 造方法存在以下不足:稳定性差，必需使用抗生素保证质粒稳定存在于A.thiooxidans中；质粒上携带的外源基因有限,不能对同一种菌多个遗传性状进行改造。无标记基因敲除一这一染色体水平稳定的遗传操作技术不仅能解决上述问题，还将为A.thiooxidans的遗传改造提供一种新方法。基因敲除技术是深入研究基因的功能、生长代谢途径关键酶和稳定改良生物遗传性状的重要遗传操作手段。发明人在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Wang H，Liu X, Liu S，Yu Y，Lin J, Lin J, Pang X, Zhao J, Appl.Environ.Microbiol.,2012，Vol.78，N0.6，1826-1835，刘相梅，王慧妍，于洋洋，刘双双，林建群，林建强，庞昕，极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除方法，国家发明专利，专利号ZL201110188474.X，授权公告日2013，01，09)以及发明人的实验室在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性喜温硫杆菌(林建群，吴燕，张成家，林建强，嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法，国家发明专利，申请号201210089108.3，申请公布日2012，07, 25)中已经建立了基于同源重组原理的无标记基因敲除方法，使用该方法敲除靶基因后，染色体上不存在抗生素抗性基因的残留，可适合基因组中多基因敲除和置换的研究。但是，在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性氧化硫硫杆菌中还没有无标记基因敲除技术的报道，阻碍了该菌的遗传改造和应用研究，而且在嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除技术中，双交换子失去了抗生素抗性基因，由于缺少选择压力以及同源重组频率低，存在双交换子筛选非常困难的问题，成为整个敲除流程中的瓶颈，需要通过分离纯化获得大量的单菌落，并对每个单菌落逐一进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测筛选和验证，不仅耗时、耗力、效率低，还增加了实验的成本。
发明内容
针对以上嗜酸性氧化硫硫杆菌中尚未建立无标记基因敲除技术以及嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除技术中存在筛选效率低和工作量大的问题，本发明提供了一种高效筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans)无标记基因敲除菌株的方法。本发明所述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans)无标记基因敲除菌株方法的技术方案是:构建含有大肠杆菌￠-半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸内切酶1-SceI特异识别作用位点、oriColEl复制原点、能进行接合转移的敲除质粒骨架，分别选择目标敲除基因上、下游长度为0.5 2.0kb的同源序列作为上、下游同源臂，设计引物进行PCR扩增，经限制性内切酶酶切后，按照在基因组上的方向分别克隆到敲除质粒骨架的多克隆位点中，构建目标基因的敲除质粒，将目标基因的敲除质粒转化具有接合转移功能的E.coliS17-1 A pir作为供体菌,通过接合转移进入A.thiooxidans受体菌中，在含卡那霉素的平板上获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的A.thiooxidans单交换子，通过以X-gal作为底物，对单交换子进行蓝色菌落验证，进一步设计引物对蓝色菌落的单交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证，构建含有酵母核酸内切酶1-SceI基因、链霉素抗性基因以及接合转移功能的广泛宿主范围特性的质粒作为诱导质粒，将诱导质粒转化具有接合转移功能的E.coli S17-1 A pir作为供体菌，通过接合转移导入A.thiooxidans单交换子·中,在含链霉素的平板上获得导入诱导质粒的接合转移子,1-SceI基因的表达产物1-SceI核酸内切酶能够切断染色体上的1-SceI位点，诱导第二次同源重组，以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛，进一步设计引物对白色菌落的双交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，筛选和验证发生了双交换的突变株，对验证的目标基因敲除突变株在不添加抗生素的无选择压力条件下转接3 5次连续传代培养，获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株。上述敲除质粒骨架携带大肠杆菌P -半乳糖苷酶基因lacZ，用于双交换子的高效筛选；携带酵母核酸内切酶1-SceI特异识别作用位点，用于诱发第二次同源重组；携带多克隆位点MCS，便于同源臂的插入；携带接合转移所需的元件oriT区，使得质粒能够通过接合转移进入A.thiooxidans细胞中；携带酸性条件下对A.thiooxidans稳定有效的卡那霉素抗性基因，用于单交换子筛选；携带oriColEl复制原点，能在大肠杆菌中复制、而不能在A.thiooxidans 中复制。上述目标基因的敲除质粒是通过将要敲除目标基因上、下游长度为0.5 2.0kb的上、下游同源臂，按照在基因组上的方向分别克隆至敲除质粒骨架的多克隆位点MCS中获得。上述目标基因的敲除质粒是通过细菌转化方法转入具有接合转移功能的大肠杆菌E.coliS17-l A pir作为供体菌,通过接合转移的方法进入A.thiooxidans受体菌中。上述含目标基因敲除质粒的供体菌与A.thiooxidans受体菌接合培养条件选28 32°C,5 9天,筛选发生了第一次同源重组的A.thiooxidans单交换子选含80 150ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板，28 32°C培养10 15天。上述验证A.thiooxidans单交换子的方法是向卡那霉素抗性平板上的单菌落表面滴加0.5 1.5uL浓度为5 20mg/mL的无菌X-gal溶液，28 35°C鮮育20 40min ；挑取蓝色菌落至10 20uL无菌水中，取0.5 1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证。上述诱导质粒 携带酵母核酸内切酶1-SceI基因，能在A.thiooxidans中表达出有活性的1-SceI,用于切割A.thiooxidans单交换子染色体上的1-SceI特异识别作用位点，诱发第二次同源重组；携带广泛宿主范围特性的复制原点，能在大肠杆菌和A.thiooxidans中高拷贝自主稳定复制，增加1-SceI酶的表达量，提高第二次同源重组的频率；携带接合转移必需的oriT区，能通过接合转移导入A.thiooxidans中；携带在酸性条件下对A.thiooxidan稳定有效的链霉素抗性基因，便于导入诱导质粒接合转移子的筛选。上述诱导质粒是通过细菌转化方法转入具有接合转移功能的大肠杆菌E.coliS17-1 A pir作为供体菌,通过接合转移的方法进入A.thiooxidans单交换子中。上述含诱导质粒的供体菌与A.thiooxidans单交换子受体菌接合培养条件选28 32°C, 48 72h,筛选导入诱导质粒的A.thiooxidans接合转移子选含80 150ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板，28 32°C培养10 15天。上述初筛A.thiooxidans双交换子的方法是挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含250 400ug/mL链霉素的Starkey-S0液体培养基中，28 32°C培养5 7天，按5 10%的接种量转接20mL上述液体培养基中，28 32°C培养5 7天，取菌液稀释后涂布已涂布80 150uL的5 20mg/mL X-gal的含80 150ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3培养基平板，28 32°C培养10 15天，获得发生第二次同源重组的白色双交换子。上述筛选和验证A.thiooxidans目标基因敲除突变株的方法是挑取链霉素平板上的白色双交换子单菌落至10 20uL无菌水中，取0.5 1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证发生了双交换的突变株。上述获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株的方法是将验证的目标基因敲除突变株稀释后涂布Starkey-Na2S2O3培养基平板，28 32°C培养10 15天，挑取平板上的单菌落接种到20mL Starkey-S0液体培养基中，28 32°C培养5 7天；再继续如上转接3 5次连续传代培养，挑取单菌落至10 20uL无菌水中，取0.5 1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证质粒丢失。上述Starkey-Na2S2O3 无机盐溶液配方为:(NH4) 2S046.0g/L, KH2P026.0g/L, MgSO4 7H201.0g/L, CaCl2 2H200.5g/L，pH4.8，121°C灭菌 20min。
上述Starkey-Na2S2O3 固体培养基配方为:A 液:(NH4)2SO40.6g，KH2PO20.6g，MgSO4
7H201.0g, CaCl2 2H200.05g，蒸馏水 IOOmL, pH4.8，121°C 灭菌 20min ；B 液:琼脂粉 2g,
蒸馏水 IOOmL, 121°C灭菌 20min ；C 液:Na2S2032.0，FeSO4 7H200.006g 溶解至 IOmL 蒸馏水中，过滤除菌;A液和B液高压灭菌后冷却至80V混合，再加入C液混合，制备固体平板。上述Starkey-Na2S2O3固体接合培养基配方为:在上述Starkey-Na2S2O3固体培养基配方A液中加入0.05%酵母粉。上述Starkey-S0 液体培养基配方为:(NH4) 2S042.0g/L, KH2P023.0g/L, MgSO4 7H200.5g/L, CaCl2 2H200.25g/L, FeSO4 7H200.01g/L，浓 H2SO4 调节至 pH2.5，121°C 灭菌20min ;硫粉放入试剂瓶中密闭，煮沸3h灭菌，接种后按10g/L加入培养基中。上述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法中:所述敲除质粒骨架优选插入大肠杆菌3 -半乳糖苷酶基因lacZ、oriColEl复制原点的大肠杆菌质粒pKIT。所述目标基因敲除质粒的构建优选将目标基因上、下游长度为0.9 1.1kb的上、下游同源臂，按照在基因组上的方向分别克隆至敲除质粒骨架的多克隆位点MCS中。所述含目标基因敲除质粒的供体菌与A.thiooxidans受体菌接合培养条件优选30°C, 7天,筛选发生了第一次同源重组的A.thiooxidans单交换子优选含100ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板,30°C培养12天，A.thiooxidans单交换子的复苏条件优选含300 u g/mL卡那霉素的Starkey-S°液体培养基，30°C培养6天。所述以X-gal作为底物,对A.thiooxidans单交换子进行蓝色菌落验证优选向卡那霉素抗性平板上的单菌落表面滴加1.0uL的12mg/mL的无菌X-gal溶液，30°C孵育30mino所述诱导质粒优选插入1-SceI基因的广泛宿主范围特性质粒PJRD215。所述含诱导质粒的供体菌与受体菌A.thiooxidans单交换子的接合培养条件优选30°C,60h,筛选导入诱导质粒的A.thiooxidanss接合转移子优选含IOOy g/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板,30°C培养12天。所述以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛优选挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含300ug/mL链霉素的Starkey_S°液体培养基中，30°C培养6天，按7%的接种量转接20mL上述液体培养基中，30°C培养6天，取菌液稀释后涂布已涂布IOOuL的12mg/mL X-gal的含100ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3培养基平板，30°C培养12天，获得发生第二次同源重组的白色双交换子。所述获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株优选通过不加链霉素的Starkey-S°液体培养30°C培养6天和Starkey-Na2S2O3固体平板30°C培养12天，连续转接4次传代培养,获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株。本发明针对A.thiooxidans中尚未建立无标记基因敲除技术以及嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除技术中存在筛选效率低和工作量大的问题，提出了一种A.thiooxidans无标记基因敲除方法和利用P -半乳糖苷酶蓝白筛选高效筛选A.thiooxidans无标记基因敲除菌株的方法。本发明在国际上率先将无标记基因敲除技术应用于A.th iooxidans,尤其率先将基于P -半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法应用于A.thiooxidans无标记基因敲除方法中，实现了通过菌落颜色简便、快捷筛选双交换子的目的，克服了嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除流程中因缺少选择压力造成的双交换子筛选困难这一瓶颈，从而大大缩短了双交换子筛选的时间、提高了双交换子筛选的效率、减少了筛选的成本。本发明建立的无标记基因敲除技术第一次同源重组的频率为2.46±1.21 X IO-7 ;转接2次后发生第二次同源重组的频率为
1.21±0.3X10'本发明能快速、稳定、高效地敲除A.thiooxidans的基因，尤其能利用P -半乳糖苷酶蓝白筛选高效筛选A.thiooxidans基因敲除突变菌株，为A.thiooxidans中未知基因功能的研究和代谢途径中关键酶作用机制的探索提供了便利，由于所得突变株不携带任何抗生素抗性基因，可适合该菌株多基因的敲除和遗传改造研究，为今后深入研究A.thiooxidans,构建高效浸矿A.thiooxidans基因工程菌安全地用于大规模工业生产提供了新途径。
图1为用于基因敲除的敲除质粒骨架pZK19的结构示意图。图2为A.thiooxidans多铜氧化酶基因(cueO)敲除流程图。图3为含有酵母核酸内切酶1-SceI基因的诱导质粒pJRD215-1-SceI的结构示意图。图4为利用P -半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法筛选获得白色A.thiooxidans双交换子。图5为A.thiooxidans cueO基因敲除菌株的PCR验证图。
图中:M，Tans2K PlusII DNA Marker,从上到下大小依次为 8，000bp、5, 000bp、3，000bp、2, 000bp、1，000bp、750bp、500bp ；ff,野生型 A.thiooxidans 基因组 DNA 为模板，扩增片段大小为3.86kb ；S, A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子基因组DNA为模板，扩增片段大小为2.7kb ;D，A.thiooxidans cueO基因敲除菌基因组DNA为模板，扩增片段大小为
I1.4kb ;引物是 CueOoutF 和 CueOoutR0图6为A.thiooxidans cueR基因敲除流程图。图7为A.thiooxidans copA基因敲除流程图。
具体实施例方式一般性说明:本发明所用极端嗜酸性氧化硫硫杆菌标准菌株A.thiooxidans ATCC19377购自ATCC(美国典型微生物菌种保藏中心)。所述质粒pKIT来源见Wang H，LiuX, Liu S，Yu Y，Lin J, Lin J, Pang X, Zhao J.Appl.Environ.Microbiol.,2012，Vol.78，N0.6，1826-1835。所述质粒 pUC19RP12 的来源见 Gyorgy Posfai, VitaliyKolisnychenko,Zsuzsa Bereczki, Frederick R Blattner.Nucleic AcidsResearch, 1999, 27:4409 4415。所述质粒 pJRD215 来源见 Davison J, HeusterspreuteM, Chevalier M, Ha-Thi V, Brunei F.Gene, 1987，Vol.51，N0.2-3, 275-280。所述质粒pUC19购自上海生工生物工程技术有限公司。所述大肠杆菌菌株JM109和K12购自TaKaRa公司。所述大肠杆菌菌株S17-1 X pir购自济南鑫兴生物科技有限公司。所用琼脂糖凝胶回收试剂盒Gel Extraction Kit、质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I和细菌基因组提取试剂盒Bacterial DNA Kit均购自Omega生物技术有限公司。所用DNA聚合酶rTaq DNAPolymerase 和 PrimerSTAR HS DNA Polymerase 购自 TAKARA 公司，TranStart FastPfu DNAPolymerase和TranFast Taq DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司。所用限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶购自TAKARA公司。所用X-gal购自上海生工生物工程技术有限公司。Tans2K PlusII Marker购自北京全式金生物技术有限公司。实施例1:极端嗜酸性氧化硫硫杆菌多铜氧化酶基因(cueO)的无标记敲除1.敲除质粒骨架PZK19的构建( I)质粒pK19的构建根据质粒pUC19的序列信息设计引物扩增其复制原点oriColEl部分:19F: 5, -CAGCGAGCTCGGGATAACGCAGGAAAGA-3'19R: 5' -CAAAGGGCCCTAATAGACTGGATGGAGGCG-3'引物19F的5’端加入Sac I酶切位点，引物19R的5’端加入Apa I酶切位点。两引物以质粒PUC19为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增获得带有PUC19oriColEl的片段。PCR 反应体系(25uL)组成如下:5 X PrimerSTAR Buffer (Mg2+plus) 5uL ；dNTPMixture (各 2.5mM)2uL ;引物 19F(IOuM) 0.25uL ;引物 19R(IOuM) 0.25uL ;质粒 pUC19 模板0.25uL ；PrimerSTAR HS DNA Polymerase (2.5U/uL) 0.25uL ;水 17uL。PCR 反应条件:98°C预变性 3min，98°C变性 10s，57°C退火 10s，72°C延伸 IminlOs，30个循环后72°C延伸5min，4°C保存。PCR扩增产物大小为1.llkb。根据质粒pKIT的序列信息设计引物扩增其多克隆位点MCS、接合转移元件oriT、卡那霉素抗性基因Knf及酵母核酸`内切酶1-SceI特异识别作用位点部分:KITF:5' -ATACGAGCTCCACCGCGGTG-3'KITR:5' -CGCGGGGCCCCGATCTCAAGAAGATCATC-3'引物KITF5’端加入Sac I酶切位点，引物KITR5’端加入Apa I酶切位点。两引物以质粒pKIT为模板，通过PCR扩增获得带有pKIT的多克隆位点MCS、接合转移元件oriT、卡那霉素抗性基因Knf及酵母核酸内切酶1-SceI特异识别作用位点的片段。PCR反应体系(25uL)组成如下:5 XPrimerSTAR Buffer (Mg2+plus) 5uL ；dNTP Mixture (各 2.5mM) 2uL ；引物 KITF(IOuM)0.25uL ;引物 KITR(IOuM) 0.25uL ;质粒 pKIT 模板 0.25uL ；PrimerSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/uL) 0.25uL ;水 17uL。PCR 反应条件同上，扩增产物大小为 1.52kb。将以上两种PCR扩增产物分别用琼脂糖凝胶分离后,用Gel Extraction Kit纯化回收，再用Sac I和Apa I两种限制性内切酶进行酶切，用T4DNA连接酶连接，转化E.coliJM109感受态细胞，获得2.6kb的中间质粒pK19。(2)敲除质粒骨架pZK19的构建根据NCBI上E.coli K12MG1655基因组中P -半乳糖苷酶基因(IacZ)序列信息，设计该基因上、下游引物扩增IacZ基因:IacZ-F:5' -TTAGGTACCCATTAGGCACCCCAGGCT-3'IacZ-R:5' -GGTAGGTACCGCGAAATACGGGCAGACAT-3'在两引物的5’端都加入了 Kpn I酶切位点，以E.coli K12的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得带有IacZ基因的片段。PCR反应体系(25uL)组成如下:5XTranStartFastPfu Buffer5uL ;dNTP Mixture (各 2.5mM)2uL ;引物 IacZ-F(IOuM)0.5uL ;引物IacZ-R(IOuM)0.5uL ；E.coli K12 基因组DNA模板 IuL ；5XPCR Stimulant2.5uL ；TranStartFastPfu DNA Polymerase0.5uL ;水 13uL。PCR 反应条件:94°C预变性 2min，94°C变性 20s，55°C退火 20s，72°C延伸 lmin40s，30个循环后72°C延伸5min，4°C保存。PCR扩增产物大小为3.17kb。将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶分离后用Gel Extraction Kit纯化回收,用Kpn I限制性内切酶进行酶切，同时将中间质粒PK19也用Kpn I酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得5.77kb的敲除质粒骨架pZK19 (图1)。2.A.thiooxidans多铜氧化酶基因(cueO)敲除质粒pZKC19的构建A.thiooxidans多铜氧化酶基因(cueO)敲除流程图见图2。根据NCBI上公布的A.thiooxidans标准菌株ATCC19377的基因组序列信息，设计引物分别扩增cueO基因上、下游部分片段作为敲除该基因的上、下游同源臂:CUHF:5' -GAGAAGCTTGAAGATGCCATTCACTCCG-3'CUHR: 5' -ATAAGGATCCCAGTGGGTGGTTGTGCTCT-3'CDHF:5' -GACGGATCCATCATTGCCACATGCTGGAACAC-3'CDHR: 5' -GATTCTAGATACAGTTTAATCCAGCCTATGCAGC-3'在引物CUHF的5，端加入Hind III酶切位点，在引物CUHR和CDHF的5，端加A BamHI酶切位点，在引物C DHR的5 ’端加入Xba I酶切位点。引物对CUHF/CUHR和CDHF/CDHR，分别以A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于敲除cueO基因的上、下游同源臂片段。PCR反应体系(25uL)组成如下:5XPrimerSTARBuffer (Mg2+Plus)5uL ;dNTP Mixture(各 2.5mM)2uL ;引物对 CUHF/CUHR 或 CDHF/CDHR(IOuM)各 0.25uL ；A.thiooxidans ATCC19377 基因组DNA 模板 0.25uL ；PrimerSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/uL) 0.25uL ;水 17uL。PCR 反应条件:98°C 预变性 3min，98°C 变性 10s，58°C (引物对 CUHF/CUHR)或55°C (引物对CDHF/CDHR)退火10s，72。。延伸lmin，30个循环后72°C延伸5min，4°C保存。PCR扩增的上、下游同源臂产物大小都为0.93kb。将以上PCR产物用Gel Extraction Kit纯化后，上游同源臂片段用Hind III和BamH I酶切，同时质粒pZK19也用这两种酶进行酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒pZK19-CUH。然后将下游同源臂用BamH I和Xba I酶切，同时将重组质粒pZK19-CUH也用BamH I和Xba I酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得cueO基因敲除质粒pZKC19。3.A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子的获得(I)质粒 pZKCl9 导入 A.thiooxidans ATCCl9377将质粒pZKC19 转化 E.coli S17-1 A pir, E.coli S17-1 X pir (pZKC19)作为接合转移供体菌，野生型A.thiooxidans ATCC19377作为接合转移受体菌。将受体菌培养在Starkey-S0液体培养基中，30°C, 180rpm,6天至对数后期,3，OOOrpm离心30s去除硫粉，10，OOOrpm离心2min收集菌体；供体菌37°C，150rpm培养4h至对数中期，8，OOOrpm离心Imin收集菌体。收集的菌体分别用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液洗漆两次,按供体菌:受体菌1: 1.5的比例混匀，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培养基平板的0.22um滤膜上，30°C培养7天。用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的接合菌液洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含100ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板上，30°C培养12天，平板上长出单菌落。(2)发生第一次同源重组的A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子的验证发生第一次同源重组的A.thiooxidans单交换子染色体上含有来自质粒pZKC19的卡那霉素抗性基因，因此在含100ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板上长出的单菌落即是A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子。向平板上的单菌落表面滴加1.0uL浓度为12mg/mL的无菌X_gal溶液，30°C孵育30min，菌落呈蓝色。挑取蓝色菌落至10 20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证。分别用以下引物:Plasmid-F:5' -CGGATTGACCGTAATGGGAT-3'CueOinR: 5' -CATTGATGAGAAAGCGGTTACC-3'验证I型单交换子，PCR扩增产物大小为2.05kb (图2)。CueOinF:5' -GCACGGAAATCTGGGAAGTC-3'Plasmid-R:5' -CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3'验证II型单交换子，PCR扩增产物大小为1.59kb (图2)。
PCR 反应体系(25uL)组成如 T:10XPCR Buffer(Mg2+plus)2.5uL ；dNTPMixture (各 2.5mM) 2uL ；引物对 Plasmid-F/CueOinR 或 CueOinF/Plasmid-R (IOuM)各
0.3uL ;菌液模板 IuL ；rTaq DNA Polymerase (5U/uL) 0.125uL ;水 18.775uL。PCR 反应条件:94°C预变性 3min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 2min，30个循环后72°C延伸5min，4°C保存。根据计数抗性平板上的单菌落数，获得质粒pZKC19转入A.thiooxidansATCC19377并整合在其染色体上的接合转移频率，即第一次同源重组的频率约为
2.46±1.21X10—7。4.诱导质粒 pJRD215-1_SceI 的构建用EcoR I和Sal I酶切质粒pUC19RP12，琼脂糖凝胶电泳分离后用GelExtraction Kit纯化回收0.82kb的条带，该片段含有酵母核酸内切酶1-SceI基因，与同样经EcoR I和Sal I酶切的质粒PJRD215连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒 pJRD215-1-SceI，见图 3。5.A.thiooxidans cueO基因敲除突变株的获得(I)质粒 pJRD215_I_SceI 导入 A.thiooxidans cueO 基因敲除单交换子将质粒pJRD215-1_SceI 转化 E.coli S17-1 A pir, E.col iS17-1 A pir (pJRD215-1-SceI)作为接合转移供体菌，A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子作为接合转移受体菌。受体菌培养在Starkey-S°液体培养基中，30°C，180rpm，6天至对数后期，3, OOOrpm离心30s去除硫粉，10, OOOrpm离心2min收集菌体；供体菌37°C, 150rpm培养4h至对数中期,8，OOOrpm离心Imin收集菌体。将收集的菌体分别用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液洗涤两次，按供体菌:受体菌1: 1.5的比例混匀，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培养基平板的0.22um滤膜上，30°C培养60h。
用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的接合菌液洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含100ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板上，30°C培养12天，平板上长出单菌落。(2)发生第二次同源重组的A.thiooxidans cueO基因敲除突变株的初筛和验证诱导质粒上携带链霉素抗性基因，在链霉素培养基平板上长出的单菌落是导入了诱导质粒的接合转移子，诱导质粒上的1-SceI基因表达产生酵母核酸内切酶1-Scel，诱导发生第二次同源重组，同时交换下来整合在染色体上的IacZ基因和卡那霉素抗性基因。所以，双交换子没有3 -半乳糖苷酶活性，也失去了卡那霉素抗性选择压力。挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含300ug/mL链霉素的Starkey-S0液体培养基中，30°C培养6天，按7%的接种量转接至20mL上述液体培养基中，30°C培养6天，取菌液稀释后涂布已涂布100uL12mg/mL X-gal的含100ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3培养基平板，30°C培养12天，白色菌落即是发生了第二次同源重组的双交换子(图4)。传代2次后发生第二次同源重组的频率为1.21±0.3X 10_2。双交换子中包括回复为野生型和cueO基因敲除突变株两种类型(原理见图2)，挑取初筛为双交换子的白色菌落至10 20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证cueO基因敲除突变株(图5)。用以下引物:CueOoutF: 5' -CCCTTCATTTCCGTTCATCTG-3'CueOoutR:5' -ACGGATTTCCTGAAGAACCC-3'PCR 反应体系(25uL)组成如 T:10XTransFast Taq Buffer2.5uL ；dNTPMixture (各 2.5mM) 2uL ;引物 CueOoutF(IOuM)0.25uL 引物 CueOoutR(IOuM) 0.25uL ;菌液模板 IuL ；TansFast Taq DNA Polymerase (2.5U/uL) 0.25uL ;水 I8.75uL。
·
PCR 反应条件:94°C预变性 3min，94°C变性 5s，56°C退火 15s，72°C延伸 2min，30 个循环后72°C延伸5min，4°C保存。PCR扩增产物大小:cue0基因敲除突变株为2.7kb，野生菌菌株为3.86kb (图5)。(2) A.thiooxidans cueO基因敲除突变株中诱导质粒的丢失将PCR扩增验证正确的cueO基因敲除突变株稀释后涂布不含抗生素的Starkey-Na2S2O3培养基平板,30°C培养12天,挑取平板上的单菌落接种到20mL Starkey-S0液体培养基中，30°C培养6天，再继续如上转接4次连续传代培养，挑取单菌落至10 20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证质粒丢失。用以下引物:SceIF:5' -GGTCCGAACTCTAAACTGCTG-3'SceIR:5' -GGGATCAGGTACGGTTTGATC-3'PCR 反应体系(25uL)组成如 T:10XPCR Buffer(Mg2+plus)2.5uL ；dNTPMixture (各 2.5mM) 2uL ;引物 SceIF(IOuM) 0.25uL 引物 SceIR(IOuM) 0.25uL ;菌液模板 IuL ；rTaq DNAPolymerase(5U/ul)0.125uL ;水 18.875uL。PCR 反应条件:94°C预变性 3min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 40s，30个循环后72°C延伸5min，4°C保存。PCR扩增诱导质粒上1-SceI基因片段，产物大小为0.62kb，电泳检测若无该扩增条带，则证明质粒已丢失。获得质粒丢失的A.thiooxidanscueO基因敲除突变株。
实施例2:嗜酸性氧化硫硫杆菌MerR家族调控蛋白基因(cueR)的无标记敲除1.A.thiooxidans cueR基因敲除质粒的构建A.thiooxidans cueR基因敲除流程图见图6。敲除质粒骨架pZK19的构建同实施例I (略)。根据NCBI上公布的A.thiooxidans标准菌株ATCC19377的基因组序列信息，设计引物分别扩增cueR基因上、下游部分片段作为敲除该基因的上、下游同源臂:RUHF: 5' -AAGTCGACCGTGCGTGATGTGGGTTAT-3'RUHR: 5' -CCAAGCTTGACTGAATTTTCACGCTCC-3'RDHF: 5' -CCAAGCTTTGGGATGTGAGTCGGGATC-3'RDHR: 5' -TTTCTAGAGGGTCACCAGCGCGGGAAC-3'在引物RUHF的5’端加入Sal I酶切位点，在引物RUHR和RDHF的5’端加入Hind III酶切位点，在引物RDHR的5’端加入Xba I酶切位点。引物对RUHF/RUHR和RDHF/RDHR，分别以A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于敲除cueR基因的上、下游同源臂片段。PCR反应体系(25uL)组成如下:5XPrimerSTARBuffer (Mg2+Plus) 5uL ;dNTP Mixture (各 2.5mM)2uL ;引物对 RUHF/RUHR 或 RDHF/RDHR(IOuM)各 0.25uL ；A.thiooxidans ATCC19377 基因组DNA 模板 0.25uL ；PrimerSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/uL) 0.25uL ;水 17uL。PCR 反应条件:98°C预变性 3min，98°C变性 10s，59。。退火 10s，72。。延伸 lmin,30个循环后72°C延伸5m in，4°C保存。PCR扩增的上、下游同源臂产物大小都为0.93kb。将以上PCR产物用Gel Extraction Kit纯化后，上游同源臂片段用Sal I和HindIII酶切，同时质粒pZK19也用这两种酶进行酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒pZK19-RUH。然后将下游同源臂用Hind III和Xba I酶切，同时将重组质粒pZK19-RUH也用Hind III和Xba I酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得cueR基因敲除质粒pZKR19 (图6)。2.A.thiooxidans cueR基因敲除单交换子的获得(I)质粒 pZKRl9 导入 A.thiooxidans ATCCl9377将质粒pZKR19 转化 E.coli S17-1 Apir, E.coli S17-1 X pir (pZKR19)作为接合转移供体菌，野生型A.thiooxidans ATCC19377作为接合转移受体菌。接合转移子的获得与实施例1相同(略)。(2)发生第一次同源重组的A.thiooxidans cueR基因敲除单交换子的验证发生第一次同源重组的A.thiooxidans cueR基因敲除单交换子的验证同实施例1 (略)，其中设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证的引物如下:Plasmid-F:5' -CGGATTGACCGTAATGGGAT-3'(同实施例1)CueRinR: 5' -GTCAGGGAAAAACCCAGATTC-3'验证I型单交换子，PCR扩增产物大小为1.87kb (图6)。CueRinF: 5' -CGGCCATGGTTCAGTAGAC-3'Plasmid-R:5' -CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3'(同实施例1)验证II型单交换子，PCR扩增产物大小为1.46kb (图6)。3.A.thiooxidans cueR基因敲除突变株的获得
诱导质粒pJRD215_I_SceI的构建、诱导质粒pJRD215_I_SceI 转入 A.thiooxidanscueR基因敲除单交换子、使用基于￠-半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法初筛发生了第二次同源重组的双交换子等原理与操作与实施例1相同(略)。双交换子中包括回复为野生型和cueR基因敲除突变株两种类型，挑取初筛为双交换子的白色菌落至10 20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证cueR基因敲除突变株。PCR反应体系的组成和PCR反应条件同实施例1 (略)。其中使用的引物为:CueRoutF: 5' -CGGGGTCGCATTACTGGTT-3'CueRoutR: 5' -CTACAGCAACCAGCATTGAAGGC-3'PCR扩增产物大小:cueR基因敲除突变株为1.15kb，野生菌菌株为1.65kb(图6)。A.thiooxidans cueR基因敲除突变株中诱导质粒的丢失操作及验证与实施例1相同(略)。 实施例3:嗜酸性 氧化硫硫杆菌copA基因的无标记敲除1.A.thiooxidans copA基因敲除质粒的构建A.thiooxidans copA基因敲除流程图见图7。敲除质粒骨架pZK19的构建见实施例I (略)。根据NCBI上公布的A.thiooxidans标准菌株ATCC19377的基因组序列信息，设计引物分别扩增copA基因上、下游部分片段作为敲除该基因的上、下游同源臂:AUHF: 5' -TATGTCGACCGATCCAGTGCCATTTCCAG-3'AUHR: 5' -GTGAAGCTTCTGCAGGAAGCACAGGTCATC-3'ADHF: 5' -CTCAAGCTTCGTTTGAAGTGGCTGCGTC-3'ADHR: 5' -CTTTCTAGAAGCCAGGTTGCCAGACCATC-3'在引物AUHF的5’端加入Sal I酶切位点，在引物AUHR和ADHF的5’端加入Hind111酶切位点，在引物ADHR的5，端加入Xba I酶切位点。弓丨物对AUHF/AUHR和ADHF/ADHR，分别以A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于敲除copA基因的上、下游同源臂片段。PCR反应体系组成及PCR反应条件与实施例2相同(略)。上、下游同源臂片段克隆至敲除质粒骨架pZK19上获得copA基因敲除质粒pZKA19(同实施例2，略)(图7)。2.A.thiooxidans copA基因敲除单交换子的获得copA基因敲除质粒pZKA19导入A.thiooxidans ATCC19377获得接合转移子的操作与实施例1相同(略)。发生第一次同源重组的A.thiooxidans copA基因敲除单交换子的筛选和验证(同实施例1，略)，其中设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证的引物如下:Plasmid-F:5' -CGGATTGACCGTAATGGGAT-3'(同实施例1)CopAinR: 5' -CTCAAATTCACGCTGGCCTG-3'验证I型单交换子，PCR扩增产物大小为2.87kb (图7)。CopAinF: 5' -GGATTTCAGCTGAATCCCATGC-3'Plasmid-R:5' -CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3'(同实施例1)验证II型单交换子，PCR扩增产物大小为1.95kb (图7)。
3.A.thiooxidans copA基因敲除突变株的获得诱导质粒pJRD215_I_SceI的构建、诱导质粒pJRD215_I_SceI 转入 A.thiooxidanscopA基因敲除单交换子、使用基于P -半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法初筛发生了第二次同源重组的双交换子等原理与操作与实施例1相同(略)。双交换子中包括回复为野生型和copA基因敲除突变株两种类型，挑取初筛为双交换子的白色菌落至10 20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证copA基因敲除突变株。PCR反应体系的组成和PCR反应条件同实施例1 (略)。其中使用的引物为:CopAoutF: 5' -CGATATGCCGGTCTTGAAAC-3'CopAoutR: 5' -CGTAAAATGGTGACATCACTGC-3'
PCR扩增产物大小:copA基因敲除突变株为3.15kb，野生菌菌株为5.51kb(图7)。A.thiooxidans copA基因敲除突变株中诱导质粒的丢失操作及验证与实施例1相同(略)。以上具体描述了本发明技术方案的操作实例，不视为对本发明的应用限制。凡操作条件的等同替换，均在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，步骤包括: (1)构建含有大肠杆菌P-半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸内切酶1-SceI特异识别作用位点、oriColEl复制原点、能进行接合转移的敲除质粒骨架； (2)分别选择目标敲除基因上、下游长度为0.5 2.0kb的同源序列作为上、下游同源臂，设计引物进行PCR扩增，经限制性内切酶酶切后，按照在基因组上的方向分别克隆到敲除质粒骨架的多克隆位点中，构建目标基因的敲除质粒； (3)将目标基因的敲除质粒转化具有接合转移功能的E.coli 317-1入!)化作为供体菌，分别收集培养至对数中期的供体菌细胞和对数后期的A.thiooxidans受体菌细胞，按照供体菌:受体菌为1:1 1:2的比例混匀，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培养基平板的滤膜上，28 32 °C培养5 9天，用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含80 150ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板上，28 32°C培养10 15天，获得具有卡那霉素抗性的接合转移子即A.thiooxidans单交换子； (4)以X-gal作为底物，对单交换子进行蓝色菌落验证，进一步设计引物对蓝色菌落的单交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证，证明单交换子发生了第一次同源重组使目标基因的敲除质粒整合到受体菌染色体上； (5)构建含有酵母核酸内切酶1-SceI基因、链霉素抗性基因以及接合转移功能的广泛宿主范围特性的质粒，作为诱导质粒； (6)将诱导质粒转化具有接合转移功能的E.coli S17-1 Xpir作为供体菌，以A.thiooxidans单交换子作为受体菌，分别收集培养至对数中期的供体菌细胞和对数后期的受体菌细胞，按照供体菌:受体菌为1:1 1:2的比例混匀，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培养基平板的滤膜上，28 32°C培养48 72h后，用Starkey-Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含80 150ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体培养基平板上，28 32°C培养10 15天，获得导入诱导质粒的接合转移子； (7)以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛，进一步设计引物对白色菌落的双交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳筛选验证，获得发生第二次同源重组且实现目标基因敲除的A.thiooxidans突变株； (8)对验证的目标基因敲除突变株在不添加抗生素的无选择压力条件下转接3 5次连续传代培养，获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株； 其特征是: 步骤(1)所述构建含有大肠杆菌3 -半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸内切酶1-SceI特异识别作用位点、oriColEl复制原点、能进行接合转移的敲除质粒骨架的方法是:选择含有卡那霉素抗性基因、含有多克隆位点MCS便于同源臂的插入、含有接合转移元件oriT区便于通过接合转移进入A.thiooxidans细胞、含有18bp的酵母核酸内切酶1-SceI特异识别作用位点便于诱发第二次同源重组、含有oriColEl复制原点、不能在A.thiooxidans中自主复制的大肠杆菌质粒，插入大肠杆菌3 -半乳糖苷酶基因IacZ获得敲除质粒骨架； 步骤(4)所述以X-gal作为底物，对单交换子进行蓝色菌落验证，进一步设计引物对蓝色菌落的单交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证，证明单交换子发生了第一次同源重组使目标基因的敲除质粒整合到受体菌染色体上的方法是:将0.5 1.5uL的5 20mg/mL无菌X-gal溶液，滴加到卡那霉素抗性平板上的单菌落表面，28 35°C放置20 40min,挑取蓝色菌落至10 20uL无菌水中，取0.5 1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证；将验证正确的菌液接种到20mL含250 400ug/mL卡那霉素的Starkey-S°液体培养基中，28 35°C培养5 7天后转接到IOOmL含250 400ug/mL卡那霉素的Starkey-S°液体培养基中，28 32°C培养5 7天； 步骤(5)所述构建含有酵母核酸内切酶1-SceI基因、链霉素抗性基因以及接合转移功能的广泛宿主范围特性的质粒，作为诱导质粒的方法是:选择具有广泛宿主范围特性的复制原点、能在E.coli和A.thiooxidans中均能自主稳定复制、拷贝数相对较高、携带链霉素抗性基因和接合转移元件oriT区的质粒；导入酵母核酸内切酶1-SceI基因，构成携带1-SceI基因的诱导质粒； 步骤(7)所述以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛，进一步设计引物对白色菌落的双交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳筛选验证，获得发生第二次同源重组且实现目标基因敲除的A.thiooxidans突变株的方法是:挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含250 400ug/mL链霉素的Starkey-S0液体培养基中，28 32°C培养5 7天，按5 10%的接种量转接20mL上述液体培养基中，28 32°C培养5 7天，取菌液稀释后涂布已涂布80 150uL的5 20mg/mL X-gal的含80 150ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3培养基平板，28 32°C培养10 15天，挑取白色菌落至10 20uL无菌水中，取0.5 1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证发生了双交换的突变株；将验证的突变株菌液接种到20mL Starkey-Sci液体培养基中，28 32°C培养5 7天，获得发生第二次同源重组且实现目标基因敲除的A.thiooxidans突变株； 步骤(8)所述对验证的目标基因敲 除突变株在不添加抗生素的无选择压力条件下转接3 5次连续传代培养，获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株的方法是:将验证的目标基因敲除突变株稀释后涂布Starkey-Na2S2O3培养基平板，28 32°C培养10 15天，挑取平板上的单菌落接种到20mL Starkey-S0液体培养基中，28 32°C培养5 7天；再继续如上转接3 5次连续传代培养，挑取单菌落至10 20uL无菌水中，取·0.5 1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证质粒丢失； 上述 Starkey-Na2S2O3 无机盐溶液配方为:(NH4) 2S046.0g/L，KH2P026.0g/L，MgSO4 7H201.0g/L, CaCl2 2H200.5g/L，pH4.8，121°C灭菌 20min ; 上述 Starkey-Na2S2O3 固体培养基配方为:A 液:(NH4)2SO40.6g，KH2PO20.6g，MgSO4 7H201.0g，CaCl2 2H200.05g，蒸馏水 100mL，pH4.8，121°C 灭菌 20min ;B 液:琼脂粉 2g，蒸馏水 IOOmL, 121°C灭菌 20min ；C 液:Na2S2032.0gjFeSO4 7H200.006g 溶解至 IOmL 蒸馏水中，过滤除菌;A液和B液高压灭菌后冷却至80V混合，再加入C液混合，制备固体平板； 上述Starkey-Na2S2O3固体接合培养基配方为:在上述Starkey-Na2S2O3固体培养基配方A液中加入0.05%酵母粉； 上述 Starkey-S0 液体培养基配方为:(NH4) 2S042.0g/L, KH2P023.0g/L, MgSO4 7H200.5g/L, CaCl2 2H200.25g/L, FeSO4 7H200.01g/L，浓 H2SO4 调节至 pH2.5，121°C 灭菌20min ;硫粉放入试剂瓶中密闭，煮沸3h灭菌，接种后按10g/L加入培养基中。
2.根据权利要求1所述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，其特征是:步骤(I)所述敲除质粒骨架选插入大肠杆菌3 -半乳糖苷酶基因lacZ、oriColEl复制原点的大肠杆菌质粒pKIT。
3.根据权利要求1所述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，其特征是:步骤(4)所述以X-gal作为底物,对A.thiooxidans单交换子进行蓝色菌落验证选向卡那霉素抗性平板上的单菌落表面滴加1.0uL的12mg/mL的无菌X-gal溶液，30°C孵育30mino
4.根据权利要求1所述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，其特征是:步骤(5)所述诱导质粒是插入1-SceI基因的广泛宿主范围特性质粒PJRD215。
5.根据权利要求1所述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，其特征是:步骤(7)所述以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛选挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含300ug/mL链霉素的Starkey_S°液体培养基中，30°C培养6天，按7%的接种量转接20mL上述液体培养基中，30°C培养6天，取菌液稀释后涂布已涂布IOOuL的12mg/mL X-gal的含100ug/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3培养基平板，30°C培养12天，获得发生第二次同源重组的白色双交换子。
6.根据权利要求1所述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，其特征是:步骤(8)所述获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株选通过不加链霉素的Starkey-S°液体培养30°C培养6天和Starkey-Na2S2O3固体平板30°C培养12天，连续转接4次传代培养,获得诱导质粒丢 失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株。
全文摘要
本发明公开了一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，采用构建目标基因的敲除质粒和携带I-SceI基因的诱导质粒，通过接合转移导入嗜酸性氧化硫硫杆菌中，使用抗性标记筛选单交换子，使用蓝白筛选初筛双交换子。本发明首次建立了嗜酸性氧化硫硫杆菌的无标记基因敲除方法，首次将β-半乳糖苷酶蓝白筛选应用于双交换子的筛选，不仅能快速、稳定、高效地敲除目标基因，而且克服了已有无标记基因敲除流程中因缺少选择压力造成的筛选困难这一瓶颈，缩短了双交换子筛选时间、提高了筛选效率、减少了筛选成本，为嗜酸性氧化硫硫杆菌稳定的遗传改造提供了便利的新方法。
文档编号C12N15/09GK103232994SQ20131002990
公开日2013年8月7日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者刘相梅, 文晴, 王慧妍, 林建群 申请人:山东大学