专利名称：一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法
技术领域：
本发明涉及一种评价免疫调节作用的方法。
背景技术：
益生乳酸菌是人及动物肠道中极为重要的生理菌群之一，与机体的多种生理功 能有着密切的关系。因为具有诸多健康功效，其在食品和保健品中的应用日益剧增。应 用含有益生菌的功能性食品来促进健康和预防疾病已经取得了很多成果，其中研究益生 菌在免疫方面的作用报道较多。虽然大多数益生菌，尤其是乳杆菌“通常被认为是安全 的”(generallyregarded as safe, GRAS)菌株，但是不能排除其可能存在的致病风险。肠道菌群在正常免疫反应中的重要作用说明改变和调节微生物群能够起到明显 的免疫调节作用。并且研究已经证实益生菌可以调节机体的免疫反应，其中，嗜酸乳杆菌是 益生菌中常见的一个种，广泛应用于食品工程技术和生产中。嗜酸乳杆菌能够调节宿主体 液的、细胞的和非特异性的免疫反应并且可能对局部细胞因子分泌以及局部免疫反应有影 响。然而，嗜酸乳杆菌引起的这些调节对宿主产生的长期的作用很难预测，仍然存在对免疫 反应有不良影响的可能性。故对其免疫调节作用的评价不容忽视。目前，对嗜酸乳杆菌免疫调节作用的评价主要依据《保健食品功能学评价程序和 检验方法》中所规定的脏器/体重比值；细胞免疫功能测定中的淋巴细胞转化实验、迟发型 变态反应；体液免疫功能测定中的抗体生成细胞检测、血清溶血素测定；巨噬细胞功能测 定和NK细胞活性测定。这些评价方法只是根据某一检测指标的阳性或阴性结果来判断是 否具有免疫调节作用，对全面、有效、整体的评价免疫调节功能有一定的局限性；并且缺少 与免疫调节功能紧密相关的细胞因子和趋化因子等的检测，无法检验其对宿主可能产生的 不良的炎症反应。因此，尚需进一步探索和建立一种全面的、有效的、整体的评价嗜酸乳杆 菌免疫调节作用的方法。
发明内容
本发明提供一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法。评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法按以下步骤实现一、将待评价的嗜酸乳杆 菌培养到对数生长后期，离心后弃去上清，用冷的PBS (磷酸盐缓冲液)洗3次，然后用DMEM 细胞培养液重悬菌体，得菌浓度为3 X 108CfU/ml的菌悬液；二、将极化状态的人结肠腺癌细 胞Caco-2用PBS洗2次，然后加入ImL的菌悬液作为实验组，加入Iml的DMEM细胞培养液 作为空白对照组，在37°C、5%C02的培养箱里共同孵育2h ；三、采用Trizol法抽提实验组和 空白对照组孵育后的人结肠腺癌细胞Caco-2的总RNA，再提取蛋白质；四、利用Real Time RT-PCR法和Western blot法对免疫调节相关基因的表达情况分别在总RNA和蛋白质水平 进行检测，检测结果通过与表1和表2中各免疫调节相关基因的表达上调或表达下调情况 及生物学功能进行比对，即可评价嗜酸乳杆菌是否具有免疫调节作用；表 1
表 2 其中步骤四中评价嗜酸乳杆菌是否具有免疫调节作用的标准若总RNA和蛋白质 水平检测结果与表1中各免疫调节相关基因的表达上调或表达下调情况全部吻合，则待评 价的嗜酸乳杆菌具有免疫调节作用；若总RNA和蛋白质检测结果与表1中免疫调节相关 基因的表达上调或表达下调情况只有部分符合的话，则对不符合的基因参照表2中免疫调 节相关基因的生物学功能来评价是否会产生不良的生物学效应，若不产生不良的生物学效 应，则待评价的嗜酸乳杆菌仍具有免疫调节作用；若产生不良的生物学效应，则待评价的嗜 酸乳杆菌不具有免疫调节作用。本发明是一套全面的、有效的、整体的评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，它克 服了现有的嗜酸乳杆菌免疫调节功能评价的不足，在《保健食品功能学评价程序和检验方 法》所规定的免疫评价检测指标的基础上，根据对嗜酸乳杆菌的研究结果，对免疫调节相 关基因(主要是一些细胞因子和趋化因子)进行检测；本发明通过对免疫调节相关基因的 RNA和蛋白质水平的检测，可以更加客观的评价嗜酸乳杆菌对宿主可能产生的不良炎症反 应等，以排除其潜在的致病危险。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法按以下步骤实 现一、将待评价的嗜酸乳杆菌培养到对数生长后期，离心后弃去上清，用冷的PBS (磷酸盐 缓冲液)洗3次，然后用DMEM细胞培养液重悬菌体，得菌浓度为3 X 108CfU/ml的菌悬液；
二、将极化状态的人结肠腺癌细胞Caco-2用PBS洗2次，然后加入ImL的菌悬液作为实验 组，加入Iml的DMEM细胞培养液作为空白对照组，在37°C、5% CO2的培养箱里共同孵育2h ；
三、采用Trizol法抽提实验组和空白对照组孵育后的人结肠腺癌细胞Caco-2的总RNA，再 提取蛋白质；四、利用Real Time RT-PCR法和Western blot法对免疫调节相关基因的表达 情况分别在总RNA和蛋白质水平进行检测，检测结果通过与表1和表2中各免疫调节相关 基因的表达上调或表达下调情况及生物学功能进行比对，评价嗜酸乳杆菌是否具有免疫调 节作用；表 1 表2 其中步骤四中评价嗜酸乳杆菌是否具有免疫调节作用的标准若总RNA和蛋白质 水平检测结果与表1中各免疫调节相关基因的表达上调或表达下调情况全部吻合，则待评 价的嗜酸乳杆菌具有免疫调节作用；若总RNA和蛋白质检测结果与表1中免疫调节相关 基因的表达上调或表达下调情况只有部分符合的话，则对不符合的基因参照表2中免疫调 节相关基因的生物学功能来评价是否会产生不良的生物学效应，若不产生不良的生物学效 应，则待评价的嗜酸乳杆菌仍具有免疫调节作用；若产生不良的生物学效应，则待评价的嗜 酸乳杆菌不具有免疫调节作用。本实施方式中DMEM细胞培养液和PBS均为市售的常规试剂。本实施方式步骤四中利用Real Time RT-PCR法和Western blot法对免疫调节相 关基因的表达情况分别在总RNA和蛋白质水平进行检测的过程1、反转录反应体系及反转条件将待检测的总RNA样品进行反转录反应，反转录成cDNA，利用EXScript RTPCR试 剂盒(购买自TakaRa公司)中的反转录部分进行反转录反应，具体反转录体系中试剂的名 称及用量如下 RT (反转录)反应条件37 "C 15min85 °C 5s2、Real Time RT-PCR法在总RNA水平检测免疫调节相关基因的表达情况针对待检测基因和内参GAPDH，利用Primer5. 0软件设计各基因特异性上下游引 物；利用EXScript RTPCR试剂盒(进行检测，反应体系为20ul，具体试剂名称及用量
如下 PCR反应条件预变性95°C IOs变性 95 °C 5s退火 60°C 34s 40次循环4 °C 保存3、利用2_δ Δετ法对Real Time RT-PCR的数据结果进行分析每种基因的PCR反应均进行扩增产物的融解曲线分析，以确定扩增产物的特异性 和纯度；各基因表达比较均采用GAPDH作为内参基因；实时荧光定量PCR最终分析的是阈 值循环或CT ；用2_Δ 将单个数据转化成线性形式来说明重复样本之间的变化和差异.实验数据均采用SPSS13. 0软件进行t检验(Student’ s t test)及方差分析，数 据以平均数加减标准差(X士 S)的形式来表示；4, Western Blot法在蛋白质水平检测免疫调节相关基因的表达情况样品在12% SDS-PAGE中电泳lh，转印于聚偏乙烯二氟膜上；经封闭液封闭2h后， TBST (pH7. 6)洗涤5次，分别于1 1000的一抗中孵育Ih ；PBST洗涤5次，在1 2000的 辣根过氧化物酶标记的二抗中孵育Ih ；TBST洗涤5次，超敏发光液显光，感光X光片后，显
影定影。体内实验含嗜酸乳杆菌的脱脂乳悬液对小鼠进行灌胃1、实验动物的分组和饲养实验动物采用昆明属小鼠(清洁级)，随机分为2组，每组10只，分别为空白对照 组和实验组；将培养到对数生长期的被评价的嗜酸乳杆菌用灭菌的脱脂乳进行悬浮，使菌 浓度为3X 108CfU/ml ；每日一次灌服给各实验组小鼠，灌服7天，其中空白对照组只灌服灭 菌脱脂乳；并于灌胃7天后处死小鼠；2、小鼠肠组织RNA和蛋白质的提取颈椎离断处死小鼠，打开腹腔，取回肠和空肠，置于预冷的生理盐水溶液中，冲洗 干净肠内容物后，置于液氮中保存；RNA的提取采用Tizol RNA提取方法抽提小鼠肠组织RNA(1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，每50 IOOmg组织加入Iml Trizol ；(2)电动勻浆器充分勻浆1 2min ；(3)按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混勻后室温放置15min ；(4) 40C、12000r/min 离心 15min ；(5)吸取上层水相，至另一离心管中，注千万不要吸取中间界面；若同时提取RNA 和蛋白质，则保留下层酚相存于4°C冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相；(6)按0. 5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混勻，室温放置5-lOmin ；(7) 40C、12000r/min 离心 lOmin，弃上清，RNA 沉于管底；(8)按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；(9) 4°C、8000r/min 离心 5min，弃上清；(10)室温晾干或真空干燥5-lOmin，即完成；注RNA样品不要过于干燥，否则很难 溶解；可用 50ul 水，TE buffer 或 0. 5% SDS 溶解 RNA 样品，55_60°C，5_10min，再测 OD 值定 量RNA浓度；其中水，TE或0. 5% SDS均须用DEPC处理并高压；蛋白质的提取称量小鼠结肠组织块直接放入研钵中，加入少量液氮研磨，待组织变软，再加 少量液氮，再研磨，如此三次，按每份组织加5份裂解液(m/V)的比例加入细胞裂解液 (50mMTris. Cl pH 6. 8、15mM NaCl、5mM EDTA、0. 5% NP-40、ImM PMSF)，于冰水中制备组织勻 浆，在冰上孵育IOmin后，以lOOOOg，IOmin离心，取上清即为蛋白质；紫外分光光度计测定 实验组和空白对照组的总蛋白浓度，并调节浓度一致； 3、Real Time RT-PCR法在总RNA水平检测免疫调节相关基因的表达情况反转录反应体系及反转条件；将待检测的RNA样品进行反转录反应，反转录成 cDNA，利用ExScriptTMRTPCR试剂盒中的反转录部分进行RT反应；利用Real Time RT-PCR法在总RNA水平对免疫调节相关基因进行检测；针对待检测基因和内参GAPDH，利用Primer5. 0软件设计各基因特异性上下游引 物；利用EXScript RTPCR试剂盒(TakaRa公司)进行检测；4、利用2_δ Δετ法对Real Time RT-PCR的数据结果进行分析每种基因的PCR反应均进行扩增产物的融解曲线分析，以确定扩增产物的特异性 和纯度；各基因表达比较均采用GAPDH作为内参基因；实时荧光定量PCR最终分析的是阈 值循环或CT，用2_δ Δετ将单个数据转化成线性形式来说明重复样本之间的变化和差异更准 确可靠；实验数据均采用SPSS13. 0软件进行t检验(Student’ s t test)及方差分析，数 据以平均数加减标准差(X士 S)的形式来表示。5, Western Blot法在蛋白质水平检测免疫调节相关基因的表达情况样品在12% SDS-PAGE中电泳lh，转印于聚偏乙烯二氟膜上；经封闭液封闭2h后， TBST (pH7. 6)洗涤5次，分别于1 1000的一抗中孵育Ih ；PBST洗涤5次，在1 2000的 辣根过氧化物酶标记的二抗中孵育Ih ；TBST洗涤5次，超敏发光液显光，感光X光片后，显
影定影。检测结果通过与表1和表2中各免疫调节相关基因的表达上调或表达下调情况及 生物学功能进行比对，即可评价嗜酸乳杆菌是否对机体具有免疫调节作用。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中离心是以 5000r/min的转速离心lOmin。其中步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中极化状态的人 结肠腺癌细胞Caco-2的培养过程a、人结肠腺癌细胞Caco-2用细胞生长培养液培养，隔天 换液，5天传代；b、将生长状态良好的人结肠腺癌细胞Caco-2以3X105cellS/cm2的初始量 接种于六孔细胞培养板上，在37°C、5% CO2培养箱下连续培养15天，即获得极化状态的人 结肠腺癌细胞Caco-2 ；其中a中步骤细胞生长培养液由90ml的DMEM细胞培养液、IOml的 胎牛血清、Ig的青霉素钠和Ig的链霉素组成。其中步骤及参数与具体实施方式
一相同。本实施方式中极化状态的人结肠腺癌细胞Caco-2可以模拟人的小肠微绒毛环
^Mi ο具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中采用Trizol 法抽提实验组和空白对照组孵育后的人结肠腺癌细胞Caco-2的总RNA的过程1、人结肠腺 癌细胞Caco-2加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；2、以12000r/min离心5min，弃 沉淀；3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混勻后室温放置15min ；4、4°C、12000" min离心15min ；5、吸取上层水相，至另一离心管中，若同时提取RNA和蛋白质，则保留下层 酚相存于4°C冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相；6、按0. 5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇 混勻，室温放置5-10min ；7、4°C、12000r/min离心lOmin，弃上清，RNA沉于管底；8、按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75 %乙醇，振荡离心管，悬浮沉淀；9、4°C、8000r/min离心5min， 弃上清；10、室温晾干或真空干燥5-lOmin，即完成。其中步骤及参数与具体实施方式
一相 同。本实施方式中步骤1中人结肠腺癌细胞Caco-2充分裂解后也可放入-70°C长期保存。本实施方式中总RNA抽提后可用50ul水，TE buffer或0. 5% SDS溶解RNA样品， 55-600C，5-10min,再测OD值定量总RNA浓度；其中水，TE或0. 5% SDS均须用DEPC处理并闻压。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中提取蛋白质 的过程1、实验组和空白对照组的人结肠腺癌细胞Caco-2加入冰的200ul细胞裂解液 (50mMTris. Cl pH 6. 8、15mM NaCl、5mM EDTA、0. 5% NP-40、ImM PMSF)冰上作用 30min，刮取 细胞于离心管中；2、4°C、14000r/min离心15min后，吸取上层澄清液，即为细胞蛋白质；3、 紫外分光光度计测定实验组和空白对照组的总蛋白浓度，并调节浓度一致。其中步骤及参 数与具体实施方式
一相同。本实施方式中调节实验组和空白对照组的蛋白质浓度一致即可，不需要具体的浓 度值。
权利要求
一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法按以下步骤实现一、将待评价的嗜酸乳杆菌培养到对数生长后期，离心后弃去上清，用冷的PBS洗3次，然后用DMEM细胞培养液重悬菌体，得菌浓度为3×108cfu/ml的菌悬液；二、将极化状态的人结肠腺癌细胞Caco 2用PBS洗2次，然后加入1ml的菌悬液作为实验组，加入1ml的DMEM细胞培养液作为空白对照组，在37℃、5％CO2的培养箱里共同孵育2h；三、采用Trizol法抽提实验组和空白对照组孵育后的人结肠腺癌细胞Caco 2的总RNA，再提取蛋白质；四、利用Real Time RT PCR法和Western blot法对免疫调节相关基因的表达情况分别在总RNA和蛋白质水平进行检测，检测结果通过与表1和表2中各免疫调节相关基因的表达上调或表达下调情况及生物学功能进行比对，即可评价嗜酸乳杆菌是否具有免疫调节作用；表1表2其中步骤四中评价嗜酸乳杆菌是否具有免疫调节作用的标准若总RNA和蛋白质水平检测结果与表1中各免疫调节相关基因的表达上调或表达下调情况全部吻合，则待评价的嗜酸乳杆菌具有免疫调节作用；若总RNA和蛋白质检测结果与表1中免疫调节相关基因的表达上调或表达下调情况只有部分符合的话，则对不符合的基因参照表2中免疫调节相关基因的生物学功能来评价是否会产生不良的生物学效应，若不产生不良的生物学效应，则待评价的嗜酸乳杆菌仍具有免疫调节作用；若产生不良的生物学效应，则待评价的嗜酸乳杆菌不具有免疫调节作用。
2.根据权利要求1所述的一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于离心 是以5000r/min的转速离心lOmin。
3.根据权利要求1所述的一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于步 骤二中极化状态的人结肠腺癌细胞Caco-2的培养过程a、人结肠腺癌细胞Caco-2用细 胞生长培养液培养，隔天换液，5天传代；b、将生长状态良好的人结肠腺癌细胞Caco-2以 3X105cellS/cm2的初始量接种于六孔细胞培养板上，在37°C、5%C02培养箱下连续培养15 天，即获得极化状态的人结肠腺癌细胞Caco-2 ；其中步骤a中细胞生长培养液由90ml的 DMEM细胞培养液、10ml的胎牛血清、lg的青霉素钠和lg的链霉素组成。
4.根据权利要求1所述的一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于步骤 三中采用Trizol法抽提实验组和空白对照组孵育后的人结肠腺癌细胞Caco-2的总RNA的 过程1、人结肠腺癌细胞Caco-2加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；2、以12000r/ min离心5min，弃沉淀；3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混勻后室温放置15min ； 4、4°C、12000r/min离心15min ；5、吸取上层水相，至另一离心管中，若同时提取RNA和蛋 白质，则保留下层酚相存于4°C冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相；6、按0. 5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混勻，室温放置5-10min ；7、4°C、12000r/min离心lOmin，弃上清，RNA 沉于管底；8、按lml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，振荡离心管，悬浮沉淀；9、4°C、 8000r/min离心5min，弃上清；10、室温晾干或真空干燥5_10min，即完成。
5.根据权利要求1所述的一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于步骤 三中提取蛋白质的过程1、实验组和空白对照组的人结肠腺癌细胞Caco-2加入冰的200ul 细胞裂解液冰上作用30min，刮取细胞于离心管中；2、4°C、14000r/min离心15min后，吸取 上层澄清液，即为细胞蛋白质；3、紫外分光光度计测定实验组和空白对照组的总蛋白浓度， 并调节浓度一致。
全文摘要
一种评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，涉及一种评价免疫调节作用的方法。方法一、将待评价的嗜酸乳杆菌培养到对数生长后期，制得菌悬液；二、将极化状态的人结肠腺癌细胞Caco-2与菌悬液共同孵育；三、采用Trizol法抽提孵育后的人结肠腺癌细胞Caco-2的总RNA，再提取蛋白质；四、利用Real Time RT-PCR法和Western blot法对免疫调节相关基因的表达情况分别在总RNA和蛋白质水平进行检测和比对即可。本发明通过对免疫调节相关基因的检测，可以更加客观的评价嗜酸乳杆菌对宿主可能产生的不良炎症反应等，以排除其潜在的致病危险。
文档编号G01N33/53GK101914627SQ20101026760
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者刘颖, 吕学娜, 姜毓君, 张光辉, 曲行光, 满朝新, 王明娜, 韩琳琳 申请人:东北农业大学