埃博拉病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种埃博拉病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，通过序列的合成、克隆载体、目的片段和载体的连接、质粒转化以及重组质粒的提取、冻干保存等步骤制得埃博拉病毒核酸分子特征标准样品，本发明制备出一种包含病毒特征序列信息、适于分析样品中该病毒及含量水平的标准样品；本发明提供的标准样品均匀性好、稳定性强、可长期保存、纯度好，并且制备方法过程简单，可以为埃博拉病毒检测研究、医用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果比对，从而保证实验室的质量控制；同时也为检验检疫机构、进出口贸易等企业实现对埃博拉病毒的快速准确检测提供了标准样品。
【专利说明】埃博拉病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种埃博拉病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法，属于分子生物 学领域。
【背景技术】
[0002] 1995年5月14日（农历四月十五)，扎伊尔发现罕见传染病埃博拉。埃博拉 (Ebola)，是用来称呼一群属于纤维病毒科埃博拉病毒属下数种病毒的通用术语，可导致埃 博拉病毒出血热，罹患此病可致人于死，包含数种不同程度的症状，包括恶心、呕吐、腹泻、 肤色改变、全身酸痛、体内出血、体外出血、发烧等，感染者症状与同为纤维病毒科的马尔堡 病毒极为相似。此病毒以非洲刚果民主共和国的埃博拉河命名（该国旧称扎伊尔)，此地接 近首次爆发的部落，刚果仍是最近四次爆发的所在地，包括2005年5月的一次大流行。
[0003] 埃博拉病毒，生物安全等级为4级(艾滋病为3级，SARS为3级，级数越大防护越 严格)。病毒潜伏期可达2至21天，但通常只有5天至10天。2014年非洲爆发此病毒疫情 中，这场有记录以来最严重的埃博拉疫情已导致932人死亡。
[0004] 目前，埃博拉病毒的诊断方法主要由病毒分尚、琼脂糖免疫扩散技术、分子生物学 等诊断技术。近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR技术以其快速、敏感、特异 性好的优点占很大优势，引起了众多研究者的关注，但现有分子生物学检测试剂盒多为公 司根据文献设计阳性对照，没有统一的标准。随着进出口贸易的增大，检验流程时限缩短， 难以保证实验室的质量控制。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明研制一种埃博拉病毒核酸分子特征标准样品，可用于特征 序列检测时的阳性对照，以保证检测结果的可溯源性。具体技术方案如下。
[0006] 本发明所述埃博拉病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，主要包括如下步骤： 1)合成病毒序列，其序列如Sequence NO. 1所述：并在每段序列前增加一个T7启动 子； 2) 将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化； 3) 目的片段和载体的连接反应； 4) 通过感受态细菌转化质粒； 5) 重组质粒提取； 6) 采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测； 7) 选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度， 然后进行分装冻干，将制备好的标准样品置于_80°C冰箱保存。
[0007] 上述埃博拉病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括重组质粒 的鉴定：即从步骤4)得到的菌液中取1-3个菌落，接种于含氨苄的LB培养基中培养，提取 质粒，然后进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆。
[0008] 上述埃博拉病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括核酸序列 测定及序列对比分析：即将经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌测序并进行同源性分析。
[0009] 本发明所获得的埃博拉病毒核酸分子特征标准样品，即为含有SequenceNO. 1的 核苷酸序列的重组载体。而且所述重组载体为质粒。
[0010] 进一步地，上述步骤2)所述克隆和胶纯化的具体步骤为：将序列平端克隆入 PUC19质粒中；酶切鉴定选择feoR1和油<3I作为质粒载体的克隆位点进行酶切，37°C，反 应l-2h，反应体系为DNA16μL，IOXbuffer2μL，feoRI1μL，ZhI1μL;酶切产物经 I%琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，胶回收纯化。
[0011] 进一步地，上述步骤3)所述目的片段和载体的连接反应具体步骤为：条件为 16°C，反应16h，反应体系为：步骤2)得到的纯化产物1μL，合成序列XμL:其与载体的 摩尔比为 3?20:1，Τ4Ligase1μL，IOXLigasesolution1μL，加去离子水补齐至 10μL。
[0012] 进一步地,上述步骤4)所述感受态细菌转化质粒的具体步骤为：将感受态细菌加 到预冷无菌的Eppendorf管内，取步骤3)得到的连接反应液，加到含DH5α感受态细菌的 管中，轻混匀，冰上静置30min，42°C热激90s，不要摇晃管，冰上静置5min，加不含氨苄的LB 培养基，37 °C，225rpm，培养Ih得转化液；取转化液涂布于含氨苄的LB固体培养基上，37°C 倒置培养16h。
[0013] 本发明是基于病毒的RNA序列与cDNA序列互补的原理基础之上，利用DNA合成技 术合成病毒的特征核酸序列，将其克隆入质粒载体中，制备出一种包含病毒特征序列信息、 适于分析样品中该病毒及含量水平的标准样品；本发明提供的标准样品均匀性好、稳定性 强、可长期保存、纯度好，并且制备方法过程简单，可以为埃博拉病毒检测研究、医用研究等 提供标准样品，以实现不同实验室结果比对，从而保证实验室的质量控制；同时也为检验检 疫机构、进出口贸易等企业实现对埃博拉病毒的快速准确检测提供了标准样品。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1质粒酶切电泳图，图2重组质粒测序图，图3序列比对报告。
【具体实施方式】
[0015] 实验材料：pUC19质粒、琼脂糖、限制性内切酶feoRI和油aI、T4Ligase试剂 盒、胶纯化试剂盒、DH5a菌株、LB培养基购于大连宝生物工程有限公司，WizardPlusSV MiniprepsDNAPurificationSystem购自promega公司。
[0016] 实施例1 :标准样品的制备 1.合成序列：利用软件CloneManager7.0从GenBank上下载公开发布的序列，进行 同源性分析和引物匹配，分析确定拟合成的病毒序列：CTACTACCACAATATCGGAACTTT TCTTTCTCATTGMAGAGMAGAGTTGMTGTAGGTAGAACCTTCGGAAMTTGCCTTAT CCGACTCGCMTGTTCAAACACTTTGTGAAGCTCTGTTAGCTGATGGTCTTGCTAMGCA TTTCCTAGCMTATGATGGTAGTTACGGAACGTGAGCAAMAGAAAGCTTATTGCATCM GCATCATGGCACCACACAAGTGATGATTTTGGTGAACATGCCACAGTTAGAGGGAGTAGC TTTGTAACTGATTTAGAGMATACMTCTTGCATTTAGATATGAGTTTACAGCACCTTTT ATAGMTATTGCAACCGTTGCTATGGTGTTMGMTGTTTTTMTTGGATGCATTATACA ATCCCACAGTGTTATATGCATGTCAGTGATTATTATAATCCACCACATAACCTCACACTG GAGAATCGAGACAACCCCCCCGAAGGGCCTAGTTCATACAGGGGTCATATGGGAGG，序 列合成委托公司完成；为便于将病毒核酸序列体外转录成RNA，在每段序列前增加一个T7 启动子，序列 20bp:TAATACGACTCACTATAGGG; 2. 将合成序列平端克隆入pUC19质粒并通过酶切鉴定及胶纯化：将序列克隆入pUC19 质粒中，经序列酶切位点分析,选择AcoRI和油<3I作为质粒载体的克隆位点进行酶切，如 图1所示，37°C，反应l_2h，反应体系如下：
【权利要求】
1. 埃博拉病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 合成病毒序列，其序列如Sequence NO. 1所述：并在每段序列前增加一个17启动 子； 2) 将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化； 3) 目的片段和载体的连接反应； 4) 通过感受态细菌转化质粒； 5) 重组质粒提取； 6) 采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测； 7) 选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度， 然后进行分装冻干，将制备好的标准样品置于_80°C冰箱保存。
2. 根据权利要求1所述的埃博拉病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在 于，所述步骤还包括重组质粒的鉴定：从步骤4)得到的菌液中取1-3个菌落，接种于含氨苄 的LB培养基中培养，提取质粒，进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克 隆。
3. 根据权利要求2所述的埃博拉病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在 于，所述步骤还包括核酸序列测定及序列对比分析：将经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌 测序并进行同源性分析。
4..由权利要求1所述方法制备的埃博拉病毒核酸分子特征标准样品，即含有 Sequence NO. 1的核苷酸序列的重组载体。
5. 根据权利要求4所述的埃博拉病毒核酸分子特征标准样品，其特征在于，所述重组 载体为质粒。
6. 根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤2)所述克隆和纯化 的具体步骤为：将序列平端克隆入PUC19质粒中；酶切鉴定选择feoR 1和油<31作为质粒载 体的克隆位点进行酶切，37°C，反应l_2h，反应体系为DNA 16iiL，10X buffer 2iiL，feoR I 1 y L，油al 1 y L ;酶切产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，胶回收纯化。
7. 根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤3)所述目的片段和 载体的连接反应具体步骤为：条件为16°C，反应16h，反应体系为：步骤2)得到的纯化产物1 yL，合成序列 X iiL:其与载体的摩尔比为 3?20:1，T4 Ligase liiL，10X Ligase solution 1 U L，加去离子水补齐至10 ii L。
8. 根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤4)所述感受态细菌 转化质粒的具体步骤为：将感受态细菌加到预冷无菌的Eppendorf管内，取步骤3)得到的 连接反应液，加到含DH5 a感受态细菌的管中，轻混匀，冰上静置30min，42°C热激90s，不要 摇晃管，冰上静置5min，加不含氨苄的LB培养基，37°C，225rpm，培养lh得转化液；取转化 液涂布于含氨节的LB固体培养基上，37°C倒置培养16h。
【文档编号】C12R1/93GK104357581SQ201410597668
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】薛芳, 李云峰, 崔丽伟, 赵亮 申请人:薛芳