专利名称：一种克隆湖羊肌细胞生成素基因编码区全序列的方法
技术领域：
本发明涉及基因克隆等领域，具体涉及一种克隆湖羊肌细胞生成素基因编码区全 序列的方法。
背景技术：
重叠延伸 PCR 技术(gene splicing by overlap extension PCR，简称 SOE PCR) 由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够在体外进 行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它 依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补 引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因 敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
发明内容
本发明目的是研究利用重叠PCR通过外显子拼接克隆湖羊肌细胞生成素基因编 码区全序列的方法，以建立一种基因克隆的新方法。本发明可通过以下具体实施步骤来实现步骤一依据已发表的波尔山羊肌细胞生成素基因序列，针对三个外显子设计三 对具有末端互补序列的特异性引物并引入酶切位点(图1)。引物序列如下(下划线部分为
酶切位点)
ExlF:5，-AGCGGATCCATGGAGCTGTATGAGACCT-3，(引入 BamHr酶切位点)；
ExlR:5，-GCATTCACTGGGCACCCCTGGCTGGGGTCC-3’ ；
Ex2F:5，-GGACCCCAGCCAGGGGTGCCCAGTGAATGC-3’ ；
Ex2R:5，-CTGGGAGCAGATGATCCCCTGGGTTGGGGC-3’ ；
Ex3F:5，-GCCCCAACCCAGGGGATCATCTGCTCCCAG-3’ ；
Ex3R:5，-AGCGAATTCTCAGTTTGGTATGGTTTCA-3，(引入 EcoRr酶切位点)
步骤:_以湖羊基因组DNA为模板，分别以ExlF, ExlR ；Ex2F、Ex2R ；Ex3F、Ex3R为
引物，扩增肌细胞生成素外显子并切胶回收，以回收的片段为模板，通过重叠PCR将其拼接 成一段核苷酸序列(SEQ NO. 1)，即湖羊肌细胞生成素基因编码区全序列。将拼接得到的核苷酸序列进行序列测定，应用DNAMAN综合分析软件，将测序结果 与已发表的波尔山羊肌细胞生成素基因编码区序列(登录号为FJ607135)对比，以验证序 列的正确性及该方法的可靠性。结果显示，拼接序列开放阅读框完整，大小与FJ607135序列一致，为675bp，两者 在132、223、364、498位点处有四个碱基的差异，同源性达99%。
如下图1重叠PCR扩增湖羊肌细胞生成素基因引物设计
图2三个外显子扩增结果，其中M. Marker ；1.外显子1 ；2.外显子2 ；3.外显子3图3三个外显子拼接结果，其中M. Marker ；1.外显子拼接序列图4拼接结果与GenBank登录号为FJ607135序列对比
具体实施例方式1.根据GenBank报道的波尔山羊肌细胞生成素基因(登录号为FJ607135)序列， 针对三个外显子分别设计三对特异性引物并引入酶切位点(下划线部分为酶切位点)ExlF :5，-AGCGGATCCATGGAGCTGTATGAGACCT-3‘(弓丨入 B α mH I 酶切位点)；Ex1R 5 ’ -GCATTCACTGGGCACCCCTGGCTGGGGTCC-3‘Ex2F 5' -GGACCCCAGCCAGGGGTGCCCAGTGAATGC-3'Ex2R 5' -CTGGGAGCAGATGATCCCCTGGGTTGGGGC-3'Ex3F 5' -GCCCCAACCCAGGGGATCATCTGCTCCCAG-3'Ex3R :5，-AGCGAATTCTCAGTTTGGTATGGTTTCA-3‘(引入 EcoR I 酶切位点)其中，ExlR5，端的15个碱基与外显子2的5，端序列互补，Ex2F5，端的15个碱基 为外显子1的3’端序列；Ex2R5’端的15个碱基与外显子3的5’端序列互补，Ex3F5’端的 15个碱基为外显子2的3’端序列(图1)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成。2.湖羊血样来自苏州市种羊场健康雄性公羊，采用酚_氯仿法提取血液基因组 DNA (具体步骤参见《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)，分别以ExlF、ExlR ；Ex2F、 Ex2R ；Ex3F、Ex3R为引物，Prime STAR高保真聚合酶扩增肌细胞生成素基因的三个外显子。 PCR反应程序98°C预变性5min ；98°C变性10s，55 °C退火15s，72 °C延伸40s，35个循环； 72°C延伸 IOmin0扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测(图2)，并用小量胶回收试剂盒回收，作为 重叠PCR的模板。3.以回收的外显子1、2、3为模板，Prime STAR高保真聚合酶扩增肌细胞生成素 基因编码区全序列。先进行第一轮PCR，反应体系中不加引物，PCR反应程序94°C预变性 5min ；94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s，5个循环；72摄氏度延伸5min。反应完 成后，在体系中加入引物ExlF、Ex3R及LATaq酶，进行第2轮PCR，反应程序为72°C延伸 2min ；94°C预变性Imin ；94°C变性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸45s，30个循环；72摄氏度 延伸lOmin。扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测(图3)，并用小量胶回收试剂盒回收， 与PMD19-T(购自Takara公司)载体连接，经BamH I、EcoRI双酶切鉴定后，送交上海生工 生物工程技术服务有限公司进行序列测定。4.应用DNAMAN综合分析软件，将测序结果与已发表的波尔山羊肌细胞生成素基 因编码区序列(登录号为FJ607135)对比，以验证序列的正确性及该方法的可靠性。结果 显示(图4)，拼接序列开放阅读框完整，大小为675bp，与FJ607135序列分别在132、223、 364,498位点处有四个碱基的差异，同源性达99%。
权利要求
一种克隆湖羊肌细胞生成素基因编码区全序列的方法，其特征在于步骤一设计并合成三对具有末端互补序列的特异性引物并引入酶切位点Ex1F5’ AGCGGATCCATGGAGCTGTATGAGACCT 3’；Ex1R5’ GCATTCACTGGGCACCCCTGGCTGGGGTCC 3’；Ex2F5’ GGACCCCAGCCAGGGGTGCCCAGTGAATGC 3’；Ex2R5’ CTGGGAGCAGATGATCCCCTGGGTTGGGGC 3’；Ex3F5’ GCCCCAACCCAGGGGATCATCTGCTCCCAG 3’；Ex3R5’ AGCGAATTCTCAGTTTGGTATGGTTTCA 3’步骤二以湖羊基因组DNA为模板，分别以Ex1F、Ex1R；Ex2F、Ex2R；Ex3F、Ex3R为引物，扩增肌细胞生成素外显子并切胶回收，以回收的片段为模板，通过重叠PCR将其拼接成SEQ NO.1所示的序列，即湖羊肌细胞生成素基因编码区全序列。
全文摘要
本发明涉及基因克隆等领域，具体涉及一种克隆湖羊肌细胞生成素基因编码区全序列的方法。该方法是依据已发表的波尔山羊肌细胞生成素基因序列，针对三个外显子设计三对具有末端互补序列的特异性引物并引入酶切位点，以湖羊基因组DNA为模板，扩增肌细胞生成素外显子并切胶回收，以回收的片段为模板，通过重叠PCR将其拼接得到湖羊肌细胞生成素基因编码区全序列，其与FJ607135序列，同源性达99％。
文档编号C12N15/12GK101899433SQ20101018764
公开日2010年12月1日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者张振韬, 李碧春, 秦玉蓉, 许峰, 阴彦辉, 陈国宏, 高波 申请人:扬州大学