专利名称：徐淮山羊体外重组过氧化氢酶体激活增殖受体的细胞定位方法
技术领域：
本发明涉及转基因、核移植、动物克隆、种质改良和细胞定位等领域，具体涉及一 种徐淮山羊体外重组过氧化氢酶体激活增殖受体的细胞定位方法。
背景技术：
过氧化S酶体激活增殖受体(Peroxisome proliferator-activatedreceptor, PPAR)是配体活化的核转录因子，属于核激素受体家族。它主要参与脂肪的形成，促进脂 肪分化和调控特殊脂肪细胞基因的表达，它可能是体内脂质平衡的生理传感器，在维持体 内脂质代谢动态平衡中起到枢纽作用。而绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)，特别是绿色荧光蛋白基因可在异源组织中表达并产生荧光，检测方法简单而不影响 宿主细胞，因而成为细胞生物学和分子生物学中广泛使用的报告蛋白。通过绿色荧光蛋白 与外源基因融合表达的方式，外源蛋白在细胞内的表定位情况旧可由绿色荧光蛋白示踪蛋 白产生的绿色荧光来反映。目前，小鼠、猪、牛、绵羊和鸡的过氧化氢酶体激活增殖受体基因 已被克隆，而徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体基因尚未被克隆，国内关于它的研究主 要集中在对其多态性的研究，该基因亚细胞定位还未见有报道。此外，过氧化氢酶体激活增 殖受体基因在临床医学研究中有重大的价值。过氧化氢酶体激活增殖受体基因如何参与调 控脂肪代谢及其与肥胖、高血脂、脂肪肝等医学难题有怎样的关系，正是科学界亟待解决的 问题。克隆出徐淮山羊的过氧化氢酶体激活增殖受体基因并研究其亚细胞定位，是为了保 存地方山羊品种遗传资源并为探索过氧化氢酶体激活增殖受体蛋白调控脂类代谢奠定科 学基础。
发明内容
本发明目的是克隆徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体基因并研究其亚细胞定 位，以保存地方山羊品种遗传资源并建立一种基因表达定位的新方法。本发明可通过以下具体步骤实现(1)构建含过氧化氢酶体激活增殖受体基因的载体PMD19-T-PPAR:以徐淮山羊 cDNA为模板，F、R为引物PCR扩增全长过氧化氢酶体激活增殖受体基因序列，PCR产物经胶 回收试剂盒纯化回收后与PMD19-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，LB含 氨苄固体培养基培养12_16h后挑选阳性克隆经菌液PCR、酶切鉴定，将含正确插入片段的 重组质粒命名为PMD19-T-PPAR，引物 F 5，-CGAAGCTTATGGTTGACACAGAGATGCCGTTT-3，引物 R :5，-CGGAATTCCTAATACAAGTCCTTGTAGATTTCC-3’ ；(2)构建含有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-Cl-PPAR:用Hind III、 EcoR I酶双切鉴定正确的PMD19-T-PPAR，胶回收目的片段，同时用Hind III、EcoR I酶双 切原始载体PEGFP-C1，回收目的载体片段；T4 DNA连接酶16°C过夜连接，产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，挑选阳性克隆经菌液PCR、酶切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒 命名为 pEGFP-Cl-PPAR ；(3).通过聚乙烯亚胺介导pEGFP-Cl-PPAR转染NIH-3T3细胞，48h后于荧光倒置 显微镜下观察细胞的发荧光部位，以确定过氧化氢酶体激活增殖受体蛋白的细胞亚定位情 况。综上所述，通过此方法可获得徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体基因cDNA完 整编码区序列并实现其亚细胞定位。
图1 过氧化氢酶体激活增殖受体基因cDNA的PCR扩增结果。其中1 过氧化氢酶 体激活增殖受体基因；M :1Kb DNA Marker (MBI公司)图2是转染pEGFP-Cl-PPAR、pEGFP-Cl和未转染质粒的NIH-3T3细胞在48h后明、 暗场下的图片A、a :EGFP-PPAR融合蛋白表达在NIH-3T3细胞的细胞质部分；B、b :EGFP荧光蛋白在NIH-3T3细胞的细胞质和细胞核部分均有表达；C、c 无荧光蛋白表达的NIH-3T3细胞。具体实施方法1、引物设计与合成根据GenBank中绵羊过氧化氢酶体激活增殖受体基因序列(登录号 NM001100921)设计全长过氧化氢酶体激活增殖受体基因的cDNA引物，并在上下游引入酶 切位点Hind III和EcoR I。引物由上海生工合成，序列如下F :5，-CGAAGCTTATGGTTGACACAGAGATGCCGTTT-3‘(下划线部分为 Hind III 酶切位 占).
/、、、 / 9R :5’ -CGGAATTCCTAATACAAGTCCTTGTAGATTTCC-3’ (下划线部分为 EcoR I 酶切位 点)o2、徐淮山羊脂肪组织RNA提取及过氧化氢酶体激活增殖受体基因cDNA扩增Trizol法抽提徐淮山羊皮下脂肪组织总RNA。以总RNA(lug)为模板，参照MBI公 司First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行反转录。以F、R为引物，徐淮山 羊cDNA为模板，扩增全长过氧化氢酶体激活增殖受体基因序列。反应体系参照LA Taq DNA 聚合酶说明书，PCR扩增参数为94°C预变性5min ；94°C变性40s ；60°C退火40s ；72°C延伸 1. 5min ；共35个循环，72°C总延伸lOmin。扩增产物用0. 8%的琼脂糖凝胶检测(图1)。PCR 产物经胶回收试剂盒纯化回收后与PMD19-T (大连宝生物公司)连接，连接产物转化大肠杆 菌DH5ci感受态细胞，LB(含氨苄)固体培养基培养12-16h。挑选阳性克隆经菌液PCR、酶 切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒命名为PMD19-T-PPAR，送上海生工测序，测序正确后 提交GenBank数据库，获得登录号⑶082382。3、pEGFP-Cl_PPAR 载体构建用Hind III、EC0R I酶双切鉴定正确的pMD19-T-PPAR，胶回收目的片段。同时用 Hind III,EcoR I酶双切原始载体pEGFP-Cl(Clontech公司)，回收目的载体片段。T4 DNA 连接酶16°C过夜连接，产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，挑选阳性克隆经菌液PCR、酶
4切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒命名为pEGFP-Cl-PPAR，送上海生工测序。4、重组质粒 pEGFP-Cl-PPAR 转染 NIH-3T3 细胞采用聚乙烯亚胺介导基因转染的方法进行，分为实验组和对照组。实验组转染重 组质粒pEGFP-Cl-PPAR ；对照组1 转染pEGFP-Cl。对照组2 未转染质粒的正常NIH-3T3细 胞。取生长良好的NIH-3T3培养至80-90%细胞汇合开始转染，转染具体过程参照聚乙烯亚 胺试剂说明书进行，转染48h后于荧光倒置显微镜下观察转染后的细胞。过氧化氢酶体激活增殖受体基因cDNA扩增结果显示该基因完整编码区大小为 1428bp，与绵羊过氧化氢酶体激活增殖受体基因完整编码区同源性达99%。pEGFP-Cl-PPAR 转染 NIH-3T3 细胞结果显示(图 2)转染 pEGFP-Cl-PPAR 48h 后， NIH-3T3细胞质中有荧光，细胞核中没有荧光；转染pEGFP-Cl 48h后，NIH-3T3细胞质和 细胞核中均有荧光；未转染质粒的正常NIH-3T3对照组中无荧光出现。用该定位方法证明 EGFP-PPAR重组蛋白定位在NIH-3T3细胞质部分。
权利要求
一种徐淮山羊体外重组过氧化氢酶体激活增殖受体的细胞定位方法，其特征在于包括以下步骤(1)构建含过氧化氢酶体激活增殖受体基因的载体pMD19-T-PPAR以徐淮山羊cDNA为模板，F、R为引物PCR扩增全长过氧化氢酶体激活增殖受体基因序列，PCR产物经胶回收试剂盒纯化回收后与pMD19-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，LB含氨苄固体培养基培养12-16h后挑选阳性克隆经菌液PCR、酶切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒命名为pMD19-T-PPAR，引物F5’-CGAAGCTTATGGTTGACACAGAGATGCCGTTT-3’引物R5’-CGGAATTCCTAATACAAGTCCTTGTAGATTTCC-3’；(2)构建含有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C1-PPAR用Hind III、EcoR I酶双切鉴定正确的pMD19-T-PPAR，胶回收目的片段，同时用Hind III、EcoR I酶双切原始载体pEGFP-C1，回收目的载体片段；T4DNA连接酶16℃过夜连接，产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆经菌液PCR、酶切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒命名为pEGFP-C1-PPAR；(3)通过聚乙烯亚胺介导pEGFP-C1-PPAR转染NIH-3T3细胞，48h后于荧光倒置显微镜下观察细胞的发荧光部位，以确定过氧化氢酶体激活增殖受体蛋白的细胞亚定位情况。
全文摘要
本发明涉及一种徐淮山羊体外重组过氧化氢酶体激活增殖受体的细胞定位方法。该方法是先构建含过氧化氢酶体激活增殖受体基因的载体pMD19-T-PPAR，再构建含有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C1-PPAR最后通过聚乙烯亚胺介导pEGFP-C1-PPAR转染NIH-3T3细胞，48h后于荧光倒置显微镜下观察细胞的发荧光部位，以确定过氧化氢酶体激活增殖受体蛋白的细胞亚定位情况。
文档编号C12N15/85GK101864427SQ201010187618
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者孙敏, 张振韬, 李碧春, 田智泉, 秦玉蓉, 许峰, 阴彦辉, 陈国宏, 高波 申请人:扬州大学