测量低密度脂蛋白胆固醇的方法

专利名称：测量低密度脂蛋白胆固醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种测量试样中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法。
背景技术：
存在于血液中的脂类化合物，除了与白蛋白结合的游离脂肪酸外，其被结合在脂 蛋白结构中，并以乳糜微粒(CHM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂 蛋白(HDL)等等的形式存在。胆固醇特别分布在VIDL、LDL和HDL中。众所周知，高含量的 LDL作用表现为输送胆固醇，加速动脉硬化。众所周知的是，对血液中低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)含量的测量是对动脉硬化的发生和进展有用的指标。在W000/17388国际公布中公开了一种量化生物标本中LDL胆固醇的方法，其特征 在于，在(a)生物标本中，(b)胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶(在此简称为CH 酶)和(c)低密度脂蛋白(以下简称为LDL)在使得上文(b)所描述的CH酶仅对低密度脂 蛋白中的胆固醇(以下简称为LDL胆固醇)发生作用的试剂存在下，进行胆固醇反应，然后 测量生成的过氧化氢或减少的辅酶，以量化LDL胆固醇的浓度。在W000/17388国际公布中 公开了环氧乙烷_环氧丙烷共聚物和聚氧乙烯衍生物被用作LDL选择性的试剂。然而，即 使根据在WO 00/17388的国际公布中所公开的方法定量化LDL-C时，仍可能出现对LDL-C 选择性不足的情况。此外，在WO 00/17388国际公布中用作聚氧乙烯衍生物的聚氧乙烯烷 基芳基醚，其不利地含有可能导致环境激素风险的化合物。特开昭(Kokai) 63-109799 (1988)公开了一种干式分析元件，其包括至少一个水 渗透层和多孔液体扩展层，这些层允许与液体接触，其中该干式分析元件进一步包括一种 在上述扩展层中的具有胆固醇酯水解活性的酶，和在上述扩展层或上述至少一个水渗透层 中的烷基苯氧聚缩水甘油。在特开昭(Kokai) 63-109799 (1988)中公开的聚缩水甘油用于 改善涂布性能。在特开昭(Kokai) 63-109799 (1988)中公开的干式分析元件不具有对低密 度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的选择性。

发明内容
本发明的目的在于提供一种测量体液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，其 可以在体液中选择性地测量低密度脂蛋白胆固醇，无需使用具有产生内分泌干扰风险的化 合物的低密度脂蛋白胆固醇选择性表面活性剂。作为针对实现上述目的的深入研究的结果，本发明人已经发现，低密度脂蛋白胆 固醇(LDL-C)在环氧乙烷-环氧丙烷共聚物和聚甘油醚的存在下，通过使用(a)胆固醇酯 酶和(b)胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶，能够被选择性地测量，而且这种测量法在多样本 相关性方面极好。本发明正是基于上述发现而完成的。本发明提供一种测量体液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，其包括在环氧 乙烷-环氧丙烷共聚物和聚甘油醚存在下，使用(a)胆固醇酯酶和(b)胆固醇氧化酶或胆 固醇脱氢酶测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
优选地，聚甘油醚是脂肪烃聚甘油醚或者多环聚甘油醚。优选地，多环聚甘油醚是以下式(1)表示的化合物 其中X代表氢原子、C1-C18烷基、或者卤素原子，其中烷基可以是直链或支链烷 基；L表示C1-C5亚烷基；m表示1至5的整数；且n表示3至20的整数。优选地，低密度脂蛋白胆固醇的测量，是通过使过氧化物酶和发色体作用于经胆 固醇酯酶和胆固醇氧化酶、由低密度脂蛋白胆固醇产生的过氧化氢，从而实现显色反应。本发明提供一种测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的试剂，其包括(a)胆固醇酯 酶，(b)胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶，(c)环氧乙烷-环氧丙烷共聚物，以及(d)聚甘油 醚。优选地，聚甘油醚是脂肪烃聚甘油醚或者多环聚甘油醚。优选地，多环聚甘油醚是以下式(1)表示的化合物 其中X代表氢原子、C1-C18烷基、或者卤素原子，其中烷基可以是直链或支链烷 基；L表示C1-C5亚烷基；m表示1至5的整数；且n表示3至20的整数。本发明提供一种用于测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的试剂盒，其包括(a)胆 固醇酯酶，(b)胆固醇氧化酶，(c)过氧化物酶，(d)发色体，(e)环氧乙烷-环氧丙烷共聚 物，和(f)聚甘油醚。本发明提供一种用于测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的干式分析元件，其包括 (a)胆固醇酯酶，(b)胆固醇氧化酶，(c)过氧化物酶，(d)发色体，(e)环氧乙烷-环氧丙烷 共聚物，和(f)聚甘油醚。通过本发明，可以选择性地测量低密度脂蛋白胆固醇。由于本发明使用了不具有 产生内分泌干扰风险的化合物的表面活性剂，所以其对环境是安全的。而且，本发明所述的 测量低密度脂蛋白胆固醇方法具有极好的多样本相关性。


图1所示为本发明方法的多检测样本相关性。图2所示为比较例方法的多检测样本相关性。图3所示为使用干式分析元件的本发明方法测量LDL-C的多检测样本相关性。
具体实施例方式下面将针对本发明的实施方式进行详细说明。本发明方法是一种测量体液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，其包括在环 氧乙烷-环氧丙烷共聚物和聚甘油醚存在下，使用(a)胆固醇酯酶和(b)胆固醇氧化酶或 胆固醇脱氢酶，测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
作为体液，可以使用血液、尿液等。作为体液试样，可以直接使用血液或者尿液。或 者，也可以使用进行过适当前处理的血液或尿液。本发明使用的环氧乙烷-环氧丙烷共聚物可以是由环氧乙烷和环氧丙烷组成的 无规或者嵌段共聚物。实例是HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)ci-H[其中a、b和c可以相同 或不同，并表示1至200的整数]所示的化合物。上述公式表示的实例化合物包括商用产 品，例如 Pluronic L—121，PluronicL-122, Pluronic L—101，Pluronic P—103 和 Pluronic F-108 (所有这些都是由ADEKA公司制造)。此外，以上描述的化合物所含的聚丙二醇基团 的分子量优选2，050或更大，更优选2，750或更大，特别优选3，250或更大。环氧乙烷-环 氧丙烷共聚物的HLB优选1至6。环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的使用浓度没有特别的限制。 优选0. 001%至20%，更优选0.01%至10%。本发明使用的聚甘油醚的结构没有特别的限制。优选脂肪烃聚甘油醚(例如，烷 基聚甘油醚)，或者多环聚甘油醚。本说明书所使用的术语“多环聚甘油醚”是指具有两个或更多个环存在于聚缩水 甘油链的一个末端的局部结构的化合物。这样的化合物优选具有连接至聚缩水甘油链一个 末端的芳基，其中该芳基具有一个或两个或更多芳基通过一个或多个连接体连接至聚缩水 甘油链，如果需要的话。这样的化合物更优选含有连接至聚缩水甘油链的一个末端的芳基， 其中该芳基具有一个或两个或多个芳基通过连接体与其相连的结构。在上述多环聚缩水甘 油化合物中，芳环优选苯环。作为连接体，可以使用直链或支链亚烷基或类似物。需要的话， 该亚烷基可以具有取代基，并且其可以在主链中包含杂原子，如氮原子、氧原子或硫原子。 根据需要通过连接体连接至芳环的芳基优选苯基。优选两个或更多个苯基通过连接体连接 至芳环。这样的苯基可以含有一个或两个或多个取代基。作为多环聚甘油醚，优选下述式(1)所示的化合物 其中X代表氢原子、C1-C18烷基、或者卤素原子，其中烷基可以是直链或支链烷 基；L表示C1-C5亚烷基；m表示1至5的整数；且η表示3至20的整数。L表示的C1-C5的亚烷基可以是直链或支链基团。作为构成L的亚甲基单元，优 选-CO 1) (R2)-(其中R1和R2的每一个各自独立表示氢原子或C1-C4烷基)表示的亚甲基单 元，和优选含有上述1至5亚甲基单元的亚烷基。优选的是，在上述亚甲基单元中，R1是氢 原子，R2是氢原子或甲基。当这样的亚烷基含有上述两个或多个亚甲基单元时，这样的亚甲 基单元可以彼此相同或不同。更具体的例子包括亚甲基、甲基亚甲基、亚乙基、甲基亚乙基、亚丙基和亚丁基。L表示的亚烷基优选包含单独的亚甲基单元。L更优选-C 1) (R2)-表示 的基团。在这种情况下，更优选R1是氢原子，R2是氢原子或甲基。X表示氢原子、C1-C18烷基或卤素原子。C1-C18烷基可以是直链基团、支链基团、 环状基团及其组合的任意之一。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁 基、2-乙基己基、辛基、壬基和癸基。作为卤素原子，可以使用氟原子、氯原子或溴原子。X 表示的基团的位置和数目没有特别的限制。当这些化合物含有两个或多个取代基X时，这 些取代基可以彼此相同或不同。字母m表示1至5的整数，当m是2或更大的整数时，所述基团可以彼此相同或 不 同。字母m表示的整数优选1至3，更优选2或3，特别优选3。字母n表示3至20的整数。优选5至18的整数，更优选8至16。可能出现一种情况，其中由上述式(1)表示的多环聚甘油醚含有一个或两个或更 多不对称碳原子，并且由于这些不对称碳原子，所以存在立体异构体(光学异构体或非对 映异构体)。所有任一给出的纯净物形式的立体异构体、任一给出的所述立体异构体的混合 物、以及消旋形式等均可用于本发明方法中。而且，还可以有式(1)所表示的多环聚甘油醚 以任一给定的水合物或溶剂化物形式存在的情形。这些物质也可以用于本发明的方法中。以下给出上述式(1)表示的多环聚甘油醚的具体实例，在所有这些实例中，取代 的苯甲基与苯环的连接位置没有特别的限制。
特别优选的化合物(5)至化合物(10)如下所示(其中取代的苯甲基与苯环的连
接位置没有特别的限制)。 式(1)表示的多环聚甘油醚可以制备如下，例如，在催化剂的存在下，添加缩水甘 油至下述式(11)表示的苯酚化合物中
(11)(其中R表示芳基(其中该芳基含有一个或两个或更多选自含有(^-(18烷基和卤 素原子的取代基)；且L和m与上述定义相同)，在此反应中，通过改变用作原材料化合物的 苯酚化合物和缩水甘油间的比率，就可以改变缩水甘油链的长度。作为催化剂，可以使用碱性催化剂。碱催化剂的例子包括碱金属和碱土金属氢氧 化物，例如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、氢氧化镁、氢氧化钙和氢氧化钡。其 中，优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯，特别优选氢氧化钾。就这些催化剂的用量而言，相 对于原材料化合物，催化剂使用的百分数为0. 0001%至1%，优选0. 001%至0. 8%，特别优 选0.005%至0.5%。上述反应通常可以在没有溶剂的情况下进行。反应的温度从室温至 200°C，优选从50°C至200°C，更优选从100°C至180°C。反应时间取决于反应温度。该时间 从1至150小时，更优选2至24小时，且特别优选2至10小时。反应完成后，反应液温度回到室温，接着用酸中和反应液。然后使用常规方法处 理，以分离目标产品。酸的例子包括无机酸如盐酸、硫酸、硝酸、氢溴酸和磷酸；和有机酸， 例如甲磺酸、乙磺酸、乙酸和对甲苯磺酸。优选使用盐酸、硫酸、磷酸、甲磺酸和乙酸。特别 优选使用盐酸、磷酸、甲磺酸和乙酸。完成中和后，当目标产品不溶于水中时，可以通过过滤分离这些目标产品。当目标产品具有高粘度时，可以加水，从而可以获得水溶液状态的目标 产品。可以出现上文所述的式(1)所示聚缩水甘油化合物以不同η值的化合物的混合物形 式产生的情况。这些混合物可以用作本发明方法中的表面活性剂。 应当指出，本发明使用的上述多环聚甘油醚在特开昭2007-306716中公开，其公 开内容的全部通过引用结合在此。本发明方法所使用的酶的实例包括胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶。 作为胆固醇酯酶，也可以使用脂肪酶。对作为这些酶来源的微生物的类型没有特别的限制。 例如，关于胆固醇酯酶，可以使用来源于裂褶菌(Schizophyllum commune)或者来源于假单 胞菌(Pseudomonas sp.)的胆固醇酯酶，或来源于其他类型微生物的酯酶。关于胆固醇氧 化酶，可以使用来源于假单胞菌、来源于链丝菌(Str印tomyces sp.)或者来源于其他类型 微生物的氧化酶。本发明中使用的酶可以是来自各种微生物的酶，或者根据公众已知方法 制备的重组体酶。来源于裂褶菌的胆固醇酯酶的一个实例是由Toyobo Co.，Ltd.制造的C0E-302。 来源于假单胞菌的胆固醇酯酶的实例包括由Toyobo Co.，Ltd制造的COE-311、LPL-312和 LPL-314，和由Asahi Kasei公司制造的CEN。来源于假单胞菌的胆固醇氧化酶的实例包括 由 Kikkoman 公司制造的 CHO-PEL 和 CH0-PEWL。在本发明的方法中，除了上述试剂之外，作为用于检测胆固醇的试剂，也可以使用 已知的酶试剂、发色体以及PH缓冲液。更具体来说，可使用过氧化物酶作为酶。作为发色体，可使用4-氨基安替比林 (4-AA)、通过供氢性偶联而发色的酚或者苯胺性Trinder试剂、无色染料等。作为Trinder 试剂，优选使用苯胺性试剂。苯胺性Trinder试剂的实例包括N-乙基-N-磺丙基-3-甲氧基苯胺(ADPS)，N-乙基-N-磺丙基苯胺(ALPS)，N-乙基-N-磺丙基-3-甲基苯胺(TOPS)，N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)_3_甲氧基苯胺(ADOS)，N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)_3，5_ 二甲氧基苯胺(DAOS)，N- (2-羟基-3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺(HDAOS)，N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)_3，5_ 二甲基苯胺(MAOS)，禾口N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(T00S)( ^ Dojindo Laboratories fjjljit)。作为pH缓冲液的实例，有碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐，以及Biochemistry第5 卷467 477页(1966年)所记载的Good pH缓冲液等。这些pH缓冲液可以参照 Tanpakushitsu Koso no Jikken Ho (蛋白质和酶的基础实验法)(堀尾武一等著，南江堂， 1981年)，和Biochemistry第5卷第467-477页，1966等文献的记载来选择。上述缓冲液的pH值可以根据所用酶的最佳pH值来确定。优选将pH调整为pH 5.0-8.0。更优选调整至pH为6. 0-7. O。本发明的测量方法在某种情况下其测量体系是以下将要描述的溶液。然而，下述 的具体实施方式
不对本发明保护范围产生限制。试剂溶液优选由以下(1)至(7)的组分组 成
(1)胆固醇酯酶(2)胆固醇氧化酶(3)环氧乙烷-环氧丙烷共聚物(4)聚甘油醚(5)过氧化物酶(6)发色体(4-AA 和 Trinder 试剂)(7)pH 缓冲液在约20°C至约45°C范围内的恒定温度下，优选在约30°C至约40°C范围内的恒定温度下，将1至1000 μ L、优选100至500 μ L的通过混合上述试剂至最佳浓度而制备的试剂 溶液预先温育1至10分钟。然后，向其中加入0. 5至50 μ L、优选1至20 μ L的溶液试样。 一边在恒温下进行温育，一边测定由于发色体的发色而导致的波长随时间的变化。可以使 用预先制作的校正曲线，通过比色测定法的原理求出试样中的测试物的量。酶的所需量可适当确定。例如，优选在0. 2和500U/mL的范围内使用胆固醇酯酶、 胆固醇氧化酶、过氧化物酶的全部，更优选在0. 2和100U/mL、进一步优选在1和50U/mL的 范围内。当测量系统是溶液时，仅环氧乙烷-环氧丙烷共聚物和聚甘油醚可用作表面活性 齐U。需要的话，一种或两种或更多类型其他的表面活性剂可以与它们组合使用。表面活性 剂的浓度没有特别的限制。例如，表面活性剂使用的浓度优选0. 01 %至20%，更优选0. 1 % 至 15%。下面将描述其中在测定系统为干试剂时的使用干式分析元件的本发明测量方法。 干式分析元件可被配置成在防水性载体上具有至少一个粘合层和多孔扩展层。上述多孔性层可以由纤维材料或非纤维材料制得。由于这些多孔层的功能是为了 液体试样的展开，因此优选为具有测量液体作用的层。在此使用的术语“测量液体作用”是 指在层的横向方向上，每单位面积以基本恒定量的比例扩展点滴施加在层表面上的液体 试样，且基本上不会使其中所含成分有不均勻分布。为了控制扩展面积、扩展速度等等，可 以将包含在特开昭 60-222770 (1985)、特开昭 63-219397 (1988)和特开昭 62-182652 (1987) 号公报所记载的亲水性聚合物或者表面活性剂混入扩展层中。还可以将多环聚缩水甘油化 合物作为表面活性剂混入该扩展层中。纤维性多孔层优选油聚酯纤维制得，包括特开昭55-164356 (1980)、特开昭 57-66359(1982)和特开昭60-222769 (1985)号公报中所描述的。作为非纤维性多孔层，优 选由例如聚磺酸的有机高分子制得。粘合层具有将上述防渗水载体粘合至上述多孔层的功能。可用于此的粘合层的例 子包括亲水性聚合物，例如明胶及其衍生物(例如，邻苯二甲酸明胶)，纤维素衍生物(例 如，羟丙基纤维素)，琼脂糖，丙烯酰胺聚合物，甲基丙烯酰胺聚合物，丙烯酰胺或甲基丙烯 酰胺与各种形式的乙烯基单体的共聚物等。可以使用公知的方法均勻涂布包含亲水性聚合物的水溶液。可以使用已知的方法 来涂布所述水溶液。为了涂布含亲水聚合物的水溶液，合适的方法可以选自浸涂、挤涂、刮 涂、漏斗涂布，幕帘涂布等。也可以在粘合层上涂布多孔层。但优选层叠作为织物在粘合层上预先提供的布帛或者多孔膜。层叠的方法如特开昭(Kokai) 55-164356 (1980)号公报所述，预先用水使包含 亲水性聚合物的粘合层的表面湿润，然后在粘合层上面放置布帛或多孔膜。再轻且均勻地 施加基本相同的压力在其上，以使布帛或多孔膜可以与粘合层相粘合。这种粘合层的厚度 优选为0. 5至50 μ m，更优选1至20 μ m。 作为透光性载体材料，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯乙烯和三乙酸纤维素等 纤维素醚类。为了使作为亲水层的吸水层、检测层、基本上无孔性的试剂层等牢固粘合在载 体上，通常可以在载体上设置下涂层，或在其上实施亲水化处理。对载体的厚度没有特别的 限制，优选10至1，000 μ m,更优选300至800 μ m。在透光性载体的情形下，最终的检测可 以是在载体一侧或在多孔层一侧进行。另一方面，在非透光性载体的情形下，最终的检测在 多孔层一侧进行。根据需要，可以使用稳定剂、PH缓冲液、交联剂(硬化剂或固化剂)、表面活性剂、
聚合物等等。这些试剂可以包容在粘合层或多孔层中。以下将针对用于干式分析元件的胆固醇测定用试剂组合物及产生光学变化的试 剂组合物进行说明。试剂组合物可以包含在第一多孔层中。但是，所述试剂组合物也可以包含在粘合 层和多孔性层两者之中。或者，试剂组合物可以全部或者大部分包含在任意一个的这样的 层中，或者这种试剂组合物可预先加入除粘合层和多孔层以外的任何层中。在LDL-C检测用干式分析元件中，所有酶，即，胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶或胆固 醇脱氢酶，任一种酶的用量优选大约0. 1至30kU/m2，更优选大约0. 5至15kU/m2。表面活性剂的用量约0. 2至30g/m2，更优选1至20g/m2。对于过氧化物酶的种类并没有特别限制。优选辣根(Horseradish)过氧化物酶。 过氧化物酶的优选用量约在1至200kU/m2，更优选约10至100kU/m2。作为上述发色体，优选通过与4-氨基安替比林(4-AA)偶联发色的上述试剂的组 合。特别优选使用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐(DA0S)。发 色体的用量没有特别的限制。例如，4-AA和氢供体耦合剂各自使用的量优选约0. 1至IOg/ m2，更优选约0. 1至5g/m2。就其他试剂组分来说，用于检测LDL-C的干式分析元件可以进一步含有一种或两 种或更多种类型的添加剂，例如稳定剂，PH缓冲液，交联剂(硬化剂或固化剂)，表面活性 齐U，聚合物等等，如果需要的话。这些添加剂可以包含在本发明的干式分析元件的粘合层和 /或多孔层中。上述缓冲液的pH值可以根据所用酶的最佳pH值来决定。pH优选调整至pH 5.0 至8. 0。更优选调整至pH 6. 0至7. 0。本发明干式分析元件优选包含其含有发色体和过氧化物酶的层，和含有胆固醇酯 酶、胆固醇氧化酶、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物和聚甘油醚的层。本发明的干式分析元件可以剪裁成例如一边为约5mm至约30mm的正方形， 或者大致相同尺寸的圆形等的小片，并可收纳在特公昭(Kokoku) 57-283331 (1982)、 实开昭(Kokai)56-142454 (1981)、特开昭(Kokai)57-63452 (1982)、实开昭 (Kokai) 58-32350 (1983)、特表昭(Kohyo) 58-501144 (1983)号公报等记载的载片框中，以 用作化学分析载片。从制造、包装、运输、保存、测定操作等的观点出发，其是优选的。根据使用目的，可以以长带状收纳于盒子或者暗盒使用。或者将小片收纳在具有开口的容器中使用，或者将小片粘贴或者收纳在开口卡中使用。或者直接进一步使用剪裁的小片，等等。在干式分析元件的应用上，在本发明的干式分析元件的多孔性液体试样扩展层上 滴加例如约2 μ L至约30 μ L、优选4 μ L至15 μ L的水性液体试样(例如，体液样本如血液 或尿液)。其后，在约20°C至约45°C的恒定温度范围内、优选在约30°C至约40°C的恒定温 度范围内对该滴加后的干式分析元件进行1至10分钟的温育。可以从透光性载体一侧对 干式分析元件内的发色或者变色进行反射测光。可以使用预先制成的校正曲线，根据比色 测定法原理确定出样中检测物的量。测量操作可以通过特公昭(Kokai)60-125543 (1985)、特开昭 60-220862(1985)、 特开昭61-294367 (1986)、特开昭58-161867 (1983)号公报等所记载的化学分析装置，非常 容易地实施高精度的定量分析。另外，根据目的或必要精度，也可以通过目视判定发色的程 度，进行半定量测定。本发明的干式分析元件在进行分析之前可以在干燥状态下储存。因此，不必在使 用前制备试剂。另外，在干燥状态下试剂通常稳定性高。因而，与必须在使用前制备的试剂 溶液的所谓溶液法相比，本发明的方法在简便性、快捷性方面更出色。另外，作为在痕量液 体试样中能够迅速进行高精度检查的本发明的方法也是优异的。下面通过实施例对本发明进行进一步具体的说明，但是这些实施例并不意味着对 本发明保护范围的限制。
实施例实施例1 对低密度脂蛋白(LDL)选择性的评价本发明和比较例的试样101至106的制备试剂1M0PS(pH 缓冲液，pH 7. 0)50mMDAOS ( S Dojindo Laboratories ^ijit)ImM(DA0S是发色体)试剂2MOPS (pH 7. 0)50mM4-氨基安替比林2. 5mMPluronic L1212. 65%聚甘油十二烷基醚(表面活性剂2)0.21%过氧化物酶(由Toyobo Co.，Ltd 制备)20U/ml胆固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，Toyobo)lU/ml胆固醇氧化酶(重组大肠杆菌，Kikkoman)3U/ml将80mg/dL HDL-C 和 250mg/dl LDL-C 作为试样。将 480 μ L 试剂 1 和 160 μ L 试 剂2混合，然后将混合物在37°C温育5分钟。5分钟后，在所得物中加入13 μ L试样，接着 在37°C下反应5分钟，如此制得试样101。同样进行上述操作，除了 Pluronic L 121的量和试样101中的试剂2中的表面活 性剂2的量及类型做如表1所示改变，如此制备试样102至106。
使用分光光度计测定每一试样，测量5分钟后在600nm的吸光度，结果总结如表2 中。这里使用的术语"Α·8(ι/Αω表示有关LDL的选择性的指标。这些值越小就表示为 对LDL的选择性越高。因此，我们发现本发明的试样对LDL均有高的选择性。表1: 聚甘油十二烷基醚 聚甘油二苯乙烯基苯基醚 聚甘油三苯乙烯基苯基醚 聚甘油三苄基苯基醚 表2: 实施例2 对混合脂蛋白中的低密度脂蛋白(LDL)选择性的评价试样101和试样103的比较试剂1M0PS(pH 缓冲液，pH 7. 0)50mMDAOS ( S Dojindo Laboratories ^ljit)ImM(DA0S是发色体)试剂2MOPS (pH 7. 0)50mM4-氨基安替比林2. 5mMPluronic L1212.65%聚甘油十二烷基醚(101)或聚甘油三苯乙烯基苯基醚(103)(表面活性剂2)0. 21%过氧化物酶(由Toyobo Co.，Ltd.制造)20U/ml胆固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，Toyobo)lU/ml胆固醇氧化酶(重组大肠杆菌，Kilckoman)3U/ml以下试样用作试样通过混合HDL 和 LDL 获得最终浓度 HDL-C 为 80mg/dL HDL-C, LDL-C 为 150mg/dl 的试样；含LDL-C最终浓度为150mg/dL的试样。将480 μ L试剂1与160 μ L试剂2混合，接着将混合物在37 V下温育5分钟。5 分钟后，将13 μ L试样加入所得物中，接着在37°C下反应5分钟。
使用分光光度计测定每一试样5分钟后在600nm下的吸光度，结果总结在表3中。 这里使用的术语“ (Ami5cwffluxi-Ami5ciVAmu5c/'表示对LDL的选择性的指标。这些值越小就表 示得到对LDL的选择性越高。在混合脂蛋白的情况下，当聚甘油三苯乙烯基苯基醚(103) 用作表面活性剂2时，可以得到对LDL高的选择性。表3: 实施例3 多检测样本相关性的评价试剂1MOPS (pH 7. 0)50mMDAOS (由 Dojindo Laboratories 制造)ImM试剂2MOPS (pH 7. 0)50mM4-氨基安替比林2. 5mMPluronic L 1214.0%聚甘油三苯乙烯基苯基醚0.21%过氧化物酶(由Ioyobo Co.，Ltd.制造)20U/ml胆固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，Toyobo)4U/ml胆固醇氧化酶(重组大肠杆菌，Kikkoman)lU/ml使用12个人的血清作为试样。将480 μ L试剂1与160 μ L试剂2混合，接着将混 合物在37°C下温育5分钟。随后将13 μ L试样加入所得物中，然后在37°C下反应5分钟。 使用分光光度计测量5分钟后600nm下的吸光度。此前预先准备一个标准曲线，其显示试 样中LDL胆固醇的浓度(通过使用商品化试剂盒测量总胆固醇HDL-C和TG获得LDL-C值， 然后通过弗里德瓦尔德(Friedewald)公式计算得出)与600nm下吸光度的相关性。使用 由此准备好的标准曲线，得到每个试样的LDL-C，然后检验测得的LDL-C与通过弗里德瓦尔 德公式计算获得的LDL值的相关性。结果如图1所示。所得的相关系数R = 0.9525。比较例2:多试样相关性按照实施例2相同的方式制备试样和进行评价，除了聚甘油三苯乙烯基苯基醚用 聚氧乙烯辛基苯基醚(HS210)替换。然后，检验获得的LDL-C和LDL值的相关性。结果如 图2所示。发现相关系数R = O. 8778。从实施例3和比较例2的结果来看，可以发现本发明的结构表现出极好的多检测 样本相关性。实施例4 用于测量LDL-C的干式分析元件在下面涂布了明胶、厚度为180μπι的聚对苯二甲酸乙二醇酯的无色、透明、平滑膜上涂布明胶水溶液，并干燥，至干燥后的厚度达到14 μ m。涂布具有以下组成的水溶液，接下来干燥。4-氨基安替比林0. 32g/m2TOOS(Dojindo Labotatories)0. 62g/m2过氧化物酶(Toyobo)12. 75kU/m2在上述薄膜上以约30g/m2的量在各个面加水使其湿润。然后轻轻施加压力，层叠 以36号规格编织相当于50尼尔的聚酯纺丝而成的经编织布料，并干燥。接着，在上述布料 上涂布下述组成的水溶液，接下来干燥。MOPS (pH 7.0)1. 67g/m2聚甘油三苯乙烯基苯基醚5.02g/m2Pluronic L 12139. 75g/m2胆固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，Toyobo)0. 65kU/m2胆固醇氧化酶(重组大肠杆菌，Kikkoman) 0. 13kU/m2在25个健康人上考察本发明方法和(溶液)直接测量方法的多检测样本相关性。 获得的结果见图3中所示。如图3所示，可以得到与(溶液)直接测量法的结果良好的相 关性。
权利要求
一种测量体液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，其包括在环氧乙烷-环氧丙烷共聚物和聚甘油醚的存在下，通过使用(a)胆固醇酯酶和(b)胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶来测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
2.权利要求1所述的方法，其中聚甘油醚是脂肪烃聚甘油醚或者多环聚甘油醚。
3.权利要求2所述的方法，其中多环聚甘油醚是下式(1)表示的化合物 其中X代表氢原子、C1-C18烷基、或者卤素原子，其中烷基可以是直链或支链烷基；L表 示C1-C5亚烷基；m表示1至5的整数；且n表示3至20的整数。
4.权利要求1所述的方法，其中低密度脂蛋白胆固醇的测量是通过使过氧化物酶和发 色体作用于经胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、由低密度脂蛋白胆固醇产生的过氧化氢，从而 实现显色反应。
5.用于测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的试剂，其包括(a)胆固醇酯酶，(b)胆固醇 氧化酶或胆固醇脱氢酶，(c)环氧乙烷-环氧丙烷共聚物，和(d)聚甘油醚。
6.权利要求5所述的试剂，其中聚甘油醚是脂肪烃聚甘油醚或多环聚甘油醚。
7.权利要求6所述的试剂，其中多环聚甘油醚是以下式(1)所表示的化合物 其中X代表氢原子、C1-C18烷基、或者卤素原子，其中烷基可以是直链或支链烷基；L表 示C1-C5亚烷基；m表示1至5的整数；且n表示3至20的整数。
8.用于测量低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其包括(a)胆固醇酯酶，(b)胆固醇氧化 酶，(c)过氧化物酶，(d)发色体，(e)环氧乙烷-环氧丙烷共聚物，和(f)聚甘油醚。
9.测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的干式分析元件，其包括(a)胆固醇酯酶，(b)胆 固醇氧化酶，(c)过氧化物酶，(d)发色体，(e)环氧乙烷-环氧丙烷共聚物，和(f)聚甘油 醚。
全文摘要
本发明的目的是提供一种测量体液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，其可以在体液中选择性地测量低密度脂蛋白胆固醇，无需使用具有产生内分泌干扰风险的化学品的低密度脂蛋白胆固醇-选择性表面活性剂。本发明提供一种测量体液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，其包括在环氧乙烷-环氧丙烷共聚物和聚甘油醚的存在下，通过使用(a)胆固醇酯酶和(b)胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶，来测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
文档编号C12Q1/26GK101864475SQ20101018738
公开日2010年10月20日 申请日期2010年3月25日 优先权日2009年3月25日
发明者M·朱马维德, 猪股弘子 申请人:富士胶片株式会社