专利名称：脂蛋白中胆固醇的分别定量法和定量用试剂的制作方法
技术范围本发明涉及对临床诊断很重要的低密度脂蛋白(以下称为LDL)中胆固醇(以下称为LDL胆固醇)的定量方法及其所用的定量试剂。此外，本发明还涉及对临床诊断很重要的高密度脂蛋白(以下称为HDL)中胆固醇(以下称为HDL胆固醇)和LDL胆固醇连续分别定量法及其所用的试剂盒。此外，本发明还涉及临床诊断中很重要的HDL胆固醇和总胆固醇〔HDL、LDL、极低密度脂蛋白(以下称为VLDL)和乳糜微粒(以下称为CM)中的所有胆固醇〕的连续分别定量法及其所用的定量试剂盒。
对于这些胆固醇浓度，可用对各胆固醇具有特异性的专用试剂分别定量，也可以将自动分析仪设定为分别定量，但人们希望对各胆固醇有更高的特异性。此外，还未知有在同一检测系统中对HDL胆固醇、LDL胆固醇、总胆固醇等进行连续分别定量的简单自动分析方法。
此外，本发明的目的还在于提供同一检品中HDL胆固醇和LDL胆固醇的连续分别定量方法及其所用的定量试剂盒。此外，本发明的目的还在于提供同一检品中HDL胆固醇和总胆固醇的连续分别定量方法及其所用的定量试剂盒。
本发明涉及以下的(1)～(27)。(1)机体样品中LDL胆固醇的定量方法，其特征在于在a)机体样品、b)胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶(以下称为CH酶类)和c)在使b)记载的CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂存在下，进行胆固醇的反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量LDL胆固醇的浓度。(2)根据(1)记载的定量方法，只作用于LDL胆固醇的CH酶类的试剂至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。(3)根据(2)记载的定量方法，其中聚氧乙烯衍生物为聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基芳香醚。(4)根据(2)或(3)记载的定量方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为通式(Ⅰ)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整数〕所示的表面活性剂。(5)机体样品中HDL胆固醇和LDL胆固醇的分别定量方法，其特征在于在a)机体样品、b)CH酶类和c)在使b)记载的CH酶类只作用于HDL胆固醇的试剂存在下，进行第1次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量HDL胆固醇的浓度；接着d)加入使b)记载的CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂，进行第2次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量LDL胆固醇的浓度。(6)机体样品中HDL胆固醇和LDL胆固醇的分别定量方法，其特征在于在
a)机体样品、b)CH酶类和c)在使b)记载的CH酶类只作用于HDL胆固醇的试剂存在下，进行第1次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量HDL胆固醇的浓度；接着加入d)CH酶类和e)加入使d)记载的CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂，进行第2次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量LDL胆固醇的浓度。(7)根据(5)或(6)记载的定量方法，其中使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂，至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。(8)根据(7)记载的定量方法，其中聚氧乙烯衍生物为聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基芳基醚。(9)根据(7)或(8)记载的定量方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为通式(Ⅰ)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整数〕所示的表面活性剂。(10)机体样品中HDL胆固醇和总胆固醇的分别定量方法，其特征在于在a)机体样品、b)CH酶类和c)在使b)记载的CH酶类只作用于HDL胆固醇的试剂存在下，进行第1次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量HDL胆固醇的浓度；接着d)加入使b)记载CH酶类作用于全部脂蛋白中的胆固醇的试剂，进行第2次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量总胆固醇。(11)机体样品中HDL胆固醇和总胆固醇的分别定量方法，其特征在于在a)机体样品、b)CH酶类和c)在使b)记载的CH酶类只作用于HDL胆固醇的试剂存在下，进行第1次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量HDL胆固醇的浓度；接着加入d)CH酶类和e)使d)记载的CH酶类作用于全部脂蛋白的胆固醇的试剂，进行第2次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量总胆固醇。(12)根据(5)～(11)任一项记载的定量方法，其中使b)记载的CH酶类只作用于HDL胆固醇的试剂，为使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂。(13)根据(12)记载的定量方法，使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂还含有不溶解凝聚脂蛋白的非离子性表面活性剂。(14)根据(12)或(13)记载的定量方法，使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂为肝素或其盐、磷钨酸或其盐、硫酸右旋糖酐或其盐、聚乙二醇、硫酸环糊精或其盐、硫酸寡糖或其盐、或它们的混合物、与2价金属盐构成的试剂。(15)根据(6)或(11)记载的定量方法，第1次胆固醇反应所用的CH酶类为化学修饰的酶，第2次胆固醇反应所用的CH酶类为未经化学修饰的酶。(16)根据(10)～(15)任一项记载的定量方法，使CH酶类作用于全部脂蛋白中的胆固醇的试剂含有溶解脂蛋白的表面活性剂。(17)由CH酶类和使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂构成的LDL胆固醇定量用试剂。(18)根据(17)记载的LDL胆固醇定量用试剂，其中使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。(19)根据(18)记载的定量试剂，其中聚氧乙烯衍生物为聚氧乙烯烷基芳基醚。(20)根据(18)或(19)记载的LDL胆固醇定量用试剂，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为通式(Ⅰ)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整数〕所示的表面活性剂。(21)分别定量HDL胆固醇和LDL胆固醇的试剂盒，由第1试剂和第2试剂构成，第1试剂为含有使HDL脂蛋白以外的脂蛋白凝聚的试剂和CH酶类的试剂，第2试剂为含有使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂的试剂。(22)根据(21)记载的试剂盒，使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。(23)根据(21)记载的试剂盒，其中聚氧乙烯衍生物为聚氧乙烯烷基芳基醚。(24)根据(21)或(22)记载的试剂盒，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为通式(Ⅰ)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整数〕所示的表面活性剂。(25)分别定量HDL胆固醇和总胆固醇的试剂盒，由第1试剂和第2试剂构成，第1试剂为含有使HDL脂蛋白以外的脂蛋白凝聚的试剂和CH酶类的试剂，第2试剂为含有使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂的试剂。(26)根据(25)记载的试剂盒，其中使CH酶类作用于全部脂蛋白中的胆固醇的试剂含有溶解脂蛋白的表面活性剂。(27)根据(21)～(26)任一项记载的试剂盒，使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂为肝素或其盐、磷钨酸或其盐、硫酸右旋糖酐或其盐、聚乙二醇、硫酸环糊精或其盐、硫酸寡糖或其盐、或它们的混合物、与2价金属盐构成的试剂。
下面对本发明进行详细的说明。
本发明涉及往含上述各种脂蛋白的机体样品中加入使CH酶类只作用于LDL胆固醇的特定试剂(以下称为试剂A)而定量LDL胆固醇的方法及其所用的试剂。
此外，本发明还涉及往含上述各种脂蛋白的机体样品中加入使CH酶类只作用于HDL胆固醇的特定试剂(以下称为试剂B)而定量HDL胆固醇，接着加入试剂A定量LDL胆固醇的分别定量方法及其所用的试剂盒。
此外，本发明还涉及往含上述各种脂蛋白的机体样品中加入试剂B定量HDL胆固醇，接着加入使CH酶类作用于全部脂蛋白中的胆固醇的试剂(以下称为试剂C)而定量总胆固醇的分别定量方法及其所用的试剂盒。
适用于本发明的机体样品没有特殊的限定，具体地说可以使用血液自身或血浆、血清等血液成分。
本发明中定量胆固醇的反应在水性介质、特别是缓冲液中进行。
作为缓冲液中所用的缓冲剂，例如有三(羟甲基)氨基甲烷、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂和Good缓冲剂等。作为Good缓冲剂，例如有N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-〔N,N-双(2-羟乙基)氨基〕-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(以下称为MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(以下称为MOPS)、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(以下称为PIPES)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙-3-磺酸)(POPSO)等。
缓冲液的pH为5～10，优选6～9。缓冲剂的浓度为5～500mM，优选20～200mM。
使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂A是不使CH酶类作用于HDL、VLDL和CM中的胆固醇的试剂。试剂A即使在使后述HDL以外脂蛋白凝聚的试剂存在下也能够使CH酶类只作用于LDL胆固醇。
作为该试剂A，例如有至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的试剂。
作为聚氧乙烯衍生物，例如有聚氧乙烯烷基芳基醚和聚氧乙烯烷基醚等；作为该烷基，为碳数8以上、例如辛基、壬基等；作为该芳基，例如有苯基等。
作为具体的聚氧乙烯衍生物，例如有Nonion HS-210、Nonion HS-215、Nonion NS-208.5、Nonion HS-208(以上为日本油脂公司制造)、Emulgen L-40、Emulgen 911、Emulgen 810(以上花王公司制造)等市售品。聚氧乙烯衍生物的亲水亲油平衡值(以下称为HLB)优选9～20。
作为聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，可以是聚氧乙烯和聚氧丙烯的无规共聚物、也可以是嵌段共聚物，例如通式(Ⅰ)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整数〕所示的化合物。
作为通式(Ⅰ)所示的化合物，例如有Pluronic L-121、PluronicL-122、Pluronic L-101、Pluronic P-103、Pluronic F-108等市售品(均为旭电化公司制造)。此外，作为通式(Ⅰ)所示化合物中聚丙二醇基团的分子量，优选2050以上，更优选2750以上，特别优选3250以上。聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的HLB优选1～6。
聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的使用浓度没有特殊的限定，优选分别各自为0.001～10％，更优选0.1～5％，特别优选0.05～1％。
作为使CH酶类只作用于HDL胆固醇的试剂B，有使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂和HDL以外的脂蛋白的抗体等。
使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂，使用含有该脂蛋白的凝聚剂和/或2价金属盐的试剂。作为凝聚剂，有肝素或其盐、磷钨酸或其盐、硫酸右旋糖酐或其盐、聚乙二醇、硫酸环糊精或其盐、硫酸寡糖或其盐、或它们的混合物等；作为环糊精，有α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精等；作为寡糖，有甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖、甘露七糖等；作为盐，有钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、镁盐等。作为2价的金属盐，有镁盐、钙盐、锰盐、镍盐等。
作为凝聚剂，使用0.02～10mM分子量5000～20000的肝素或其盐、0.1～10mM分子量4000～8000的磷钨酸或其盐、0.01～5mM分子量10000～500000的硫酸右旋糖酐或其盐、0.1～20mM分子量1000～10000的硫酸右旋糖酐或其盐、0.3～100mM分子量4000～25000的聚乙二醇(PEG)、0.1～50mM分子量1000～3000的硫酸环糊精或其盐、0.1～50mM分子量400～3000的硫酸寡糖或其盐、或它们的混合物。优选使用0.03～1mM分子量14000～16000的肝素或其盐、0.1～3mM分子量5000～7000的磷钨酸或其盐、0.01～5mM分子量150000～250000的硫酸右旋糖酐或其盐、0.1～10mM分子量1000～5000的硫酸右旋糖酐或其盐、1.0～50mM分子量5000～22000的PEG、0.1～10mM分子量1000～2000的硫酸环糊精或其盐、0.1～10mM分子量400～2000的硫酸寡糖或其盐、或它们的混合物等。
作为2价金属，有0.1～50mM的镁盐、钙盐、锰盐、镍盐、钴盐等，优选0.1～50mM的镁盐。
使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂优选含有不溶解凝聚脂蛋白的非离子性表面活性剂。
作为不溶解凝聚脂蛋白的非离子性表面活性剂，有聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基苯磺酸盐等。其中，作为聚氧乙烯烷基醚，优选聚氧乙烯醚〔Emulgen 220(花王公司制造)〕；作为聚氧乙烯烷基芳基醚，优选市售品Emulgen B66等；作为聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物，优选市售品Plurconic F88(旭电化公司制造)等；优选聚氧乙烯烷基醚硫酸钠〔作为市售品，有Emal 20C(花王公司制造)等〕；作为烷基苯磺酸盐，优选十二烷基苯磺酸钠。
不溶解凝聚脂蛋白的非离子性表面活性剂，只要不使CH酶类不能作用于LDL胆固醇，可以组合使用，优选单独使用。所用浓度没有特殊的限定，优选0.01～10％，特别优选0.1～5％。
HDL以外脂蛋白的抗体，有抗阿朴脂蛋白B抗体、抗阿朴脂蛋白C抗体、抗阿朴脂蛋白E抗体、抗β脂蛋白抗体等，单独或组合使用。作为抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。此外这些抗体可以是用酶或化学分解、修饰的。
作为使CH酶类作用于全部脂蛋白中的胆固醇的试剂C，例如有溶解全部脂蛋白的表面活性剂。
作为该表面活性剂，使用溶解HDL、LDL、VLDL和CM的脂蛋白的非离子性表面活性剂。具体地说，有作为市售品的Triton X-100等非离子表面活性剂、Emulgen 106、Emulgen 108、Emulgen 709等聚氧乙烯烷基醚等。这些表面活性剂可以单独或组合使用。所用浓度没有特殊的限定，优选0.01～10％，特别优选0.1～5％。
作为本发明所用的具有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和胆固醇脱氢酶活性的酶，例如有具水解胆固醇酯能力的微生物或动物来源的胆固醇酯酶和脂蛋白脂肪酶、氧化胆固醇生成过氧化氢的微生物来源胆固醇氧化酶、微生物或动物来源的胆固醇脱氢酶等。
这些酶根据特异的基质而使用。例如定量HDL胆固醇时优选使用对该胆固醇特异的酶，定量LDL胆固醇时优选使用对该胆固醇特异性的酶。为了进一步赋予这些酶特异性、稳定性，用聚乙二醇为主要成分的基团、水溶性寡糖残基、磺丙基等对这些酶进行化学修饰。此外，也可使用基因工程所得的酶。
作为用于修饰酶的试剂(化学修饰剂)，为聚乙二醇上结合有可结合氨基的基团的化合物，例如聚乙二醇上结合有能够和N-羟基琥珀酰亚氨基等氨基结合的基团的サンブライド VFM4101〔日本油脂公司制造〕等、具有聚烷撑二醇结构和酸酐结构的サンブライド AKM系列、同类的ADM系列、同类的ACM系列〔皆为日本油脂公司制造化学工学论文集，第20卷，第3号，459页，1994年〕、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物上结合有能结合氨基的化合物、聚乙二醇单甲基丙烯酰单甲基醚和马来酸酐的共聚物等。此外，可以使用作为聚氨酯化学修饰剂的活化聚氨酯P4000(Beringer Mannhaim公司制造，酶修饰规程手册)、作为右旋糖酐化学修饰剂的右旋糖酐T40、活化TCT(同)、1,3-丙烷サルトン等。应用这些化学修饰剂，可以修饰酶、以聚乙二醇为主要成分的基团、以聚丙二醇为主要成分的基团、具有聚丙二醇和聚乙二醇共聚物的基团、结构中含糖的基团、磺丙基、聚氨酯基团等。
酶和上述化学修饰剂反应的方法应用《蛋白质的杂交》、稻田佑二著、共立出版社(1987年)等记载的方法。例如使用サンブライド时，将酶溶解于pH8以上的HEPES缓冲液等缓冲液中，在0～50℃下加入0.01～500倍摩尔量的サンブライド，搅拌5～60分钟。此反应液可以保持原样或根据需要以超过滤膜除去低分子物后使用。
本发明中胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和胆固醇脱氢酶的用量在反应液中分别优选0.01～200U/毫升，更优选0.1～100U/毫升。
在本发明中，HDL胆固醇定量时使用的CH酶类在LDL胆固醇或HDL以外的胆固醇或总胆固醇定量时也可以就这样使用，也可以在LDL胆固醇或HDL以外的胆固醇或总胆固醇定量时加入新的相同或底物特异性不同的CH酶类。
HDL胆固醇定量时所用的CH酶类优选使用化学修饰的酶，LDL或HDL以外的脂蛋白中胆固醇或总胆固醇定量时优选使用没有化学修饰的CH酶类。
在本发明的胆固醇反应中，在对反应特异性没有影响的范围内为了活化CH酶类可以使用常用的表面活性剂或胆酸类；此外，为了溶解球蛋白等可以使用各种盐类。
作为活化CH酶类的表面活性剂，例如阴离子表面活性剂在0～1％的范围内使用。作为胆酸，胆酸、去氧胆酸、牛磺胆酸、鹅去氧胆酸等在0～5％的范围内使用。作为阴离子表面活性剂，有1-戊磺酸盐、1-己磺酸盐、1-庚磺酸盐、1-辛磺酸盐等烷基磺酸盐在0～5％的范围内使用。
作为盐类，氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、氯化锂、硫酸锂、氯化铵、硫酸铵、硝酸镁、硝酸钙等在0～100mM的范围内使用。
胆固醇反应用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶进行时，生成过氧化氢。生成的过氧化氢，例如可以在过氧化酶的存在下，用4-氨基安替比林和酚类、4-氨基安替比林和トリ ンダ-试剂或高敏感度的色素源进行定量。
作为酚类，例如有苯酚、4-氯苯酚、间甲酚、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
作为トリンダ-试剂(同仁化学研究所第19版总目录、1994年)，有N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-磺丙基-间甲苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N-二甲基-间甲苯胺、N,N-二磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-间甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺、N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺等苯胺类或N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰基乙二胺等。
作为高敏感度的色素源，有特公昭60-33479所示的10-(N-甲基氨基甲酰基)-3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪(MCDP)、特公平4-27839所示的双〔3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基〕胺(BCMA)、特开昭62-296所示的化合物等。
作为这些色素源的浓度，优选0.01～10毫克/毫升。
胆固醇的反应，在底物氧化型辅酶NAD(P)存在下，应用胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶进行反应时，生成还原型辅酶NAD(P)H。 NAD(P)H可以在300～500nm、优选330～400nm、特别优选约340nm下通过测定反应液的吸光度而定量。还有，NAD(P)H的定量可以通过加入黄递酶、四唑鎓盐使甲色素生色，然后对甲色素进行比色。
定量LDL胆固醇的反应在10～50℃下、优选30～40℃下进行，通常在37℃下、进行1～30分钟，优选2～10分钟。
分别定量时，定量HDL胆固醇的反应(以下称为第1反应)在10～50℃下、优选30～40℃下进行，通常在37℃下、进行1～30分钟，优选2～10分钟；定量LDL胆固醇或总胆固醇的反应(以下称为第2反应)在10～50℃下、优选30～40℃下进行，通常在37℃下、进行1～30分钟，优选2～10分钟。第2反应的开始可以是第1反应实质上终止后、第1反应进行中或完成了HDL定量的任一个时期。第2反应在添加了特异作用于LDL胆固醇的CH酶类的试剂A或作用于全部脂蛋白中胆固醇的CH酶类的试剂C和根据需要的CH酶类后开始。定量第2反应中产生的过氧化氢或还原型辅酶〔NAD(P)H〕的试剂可以是第1反应液中使用的，也可根据需要加入新的。
在本发明中，HDL胆固醇反应后进行LDL胆固醇的反应，分别定量HDL胆固醇和LDL胆固醇时，如上述的LDL胆固醇反应以添加试剂A引发；第1的HDL胆固醇反应，在添加上述不溶解HDL以外凝聚脂蛋白的非离子表面活性剂、即聚氧乙烯衍生物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的任一个引发时，第2的LDL胆固醇反应，可以添加HDL胆固醇反应中所用的表面活性剂及试剂A组成的表面活性剂引发。
各脂蛋白中胆固醇的浓度根据使用样品时各反应前后吸光度的差(ΔOD)和使用各种脂蛋白中胆固醇浓度已知的样品时吸光度的差(ΔODstd)按下面的计算方法算出。
LDL胆固醇浓度可从ΔOD÷ΔODstd×(已知的LDL胆固醇浓度)求出。HDL胆固醇浓度例如可以从ΔOD÷ΔODstd×(已知的HDL胆固醇浓度)求出。还有，分别定量时，第1反应和第2反应生成的化合物相同、检测方法相同时，总胆固醇浓度用第1反应前和第2反应后的吸光度差按ΔOD÷ΔODstd×(已知的总胆固醇浓度)算出。
作为本发明的LDL胆固醇定量试剂，为含有CH酶类、聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的试剂。该LDL定量试剂中可根据需要含有上述缓冲剂、凝聚HDL以外脂蛋白的试剂、定量胆固醇所用的表面活性剂、胆酸类、各种盐类、过氧化酶等酶、4-氨基安替比林和トリンダ-试剂等色源等、NAD(P)等氧化型辅酶。
本发明的分别定量HDL胆固醇和LDL胆固醇的试剂盒，由第1试剂和第2试剂的试剂盒构成，例如第1试剂由含有HDL以外脂蛋白的凝聚剂和CH酶类的试剂构成，第2试剂由含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的试剂构成。
此外，本发明的分别定量HDL胆固醇和总胆固醇的试剂盒，由第1试剂和第2试剂的试剂盒构成，例如第1试剂由含有HDL以外脂蛋白的凝聚剂和CH酶类的试剂构成，第2试剂由含有溶解全部脂蛋白(HDL、LDL、VLDL和CM)的非离子性表面活性剂的试剂构成。
本发明试剂盒的第1试剂或第2试剂中，可根据需要含有上述缓冲剂、定量胆固醇所用的表面活性剂、胆酸类、各种盐类、过氧化酶等酶、4-氨基安替比林和トリンダ-试剂等色源等、NAD(P)等氧化型辅酶。
第2试剂中，可根据需要使用和第1试剂相同或不同来源的CH酶类。第1试剂中使用的CH酶类优选上述化学修饰的酶，第2试剂中使用的CH酶类优选使用没有化学修饰的酶。
图2表示本发明方法(图中以DB LDL-C表示)所得的LDL胆固醇浓度和对照方法(L LDL-C方法，图中以S LDL-C表示)所得的LDL胆固醇浓度的相关性。
图3表示本发明方法(图中以DB-TC表示)所得的总胆固醇浓度和对照方法(Determiner LTC Ⅱ方法，图中以L TC Ⅱ表示)所得的总胆固醇浓度的相关性。
图4表示本发明方法(图中以DB HDL-C表示)所得的HDL胆固醇浓度和对照方法(LHDL-C方法，图中以SHDL-C表示)所得的HDL胆固醇浓度的相关性。
图5表示本发明方法(图中以本法表示)所得的LDL胆固醇浓度和对照方法(图中以对照方法表示)Friedewald的计算式所得的LDL胆固醇浓度的相关性。
发明实施的最佳形式实施例1(HDL胆固醇和LDL胆固醇的定量)试剂1(pH=7)MES(Nakalai Tesque公司制造) 20mM硫酸右旋糖酐(东京化成公司制造)0.23毫克/毫升硫酸镁(关东化学公司制造) 1.5毫克/毫升HDAOS(同仁化学公司制造) 0.23毫克/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造) 0.13毫克/毫升聚乙二醇修饰的胆固醇酯酶(*1) 0.25U/毫升聚乙二醇修饰的胆固醇氧化酶(*2)1.65U/毫升过氧化酶(东洋纺公司制造) 12.5U/毫升*1:50克胆固醇酯酶(天野制药公司制造)溶于1升0.1M HEPES缓冲液(pH8.5)，在25℃下加入330克サンブライトVFM4101，搅拌2小时调制而成。
*2:50克胆固醇氧化酶(协和发酵工业公司制造)溶于1升0.1MHEPES缓冲液(pH8.0)，在15℃下加10克サンブライトVFM4101，搅拌2小时调制而成。试剂2(pH=7)MES(Nakalai Tesque公司制造) 20mM胆固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶、东洋纺公司制造)3U/毫升胆固醇氧化酶(协和发酵工业公司制造) 2U/毫升Pluronic L-121(旭电化公司制造) 0.7％Emulgen L-40(花王公司制造) 0.5％氯化钙(和光纯药公司制造)0.1毫克/毫升作为样品，使用健康人血清样30份，按下述操作定量样品中HDL胆固醇和LDL胆固醇。往2.25毫升试剂1中加入30微升样品，搅拌，随后测定585nm的吸光度E1。接着在37℃下反应5分钟后，测定相同吸收波长的吸光度E2。往其中再加入0.75毫升试剂2，搅拌，随后测定585nm的吸光度E3。接着在37℃下反应5分钟后测定相同吸收波长的吸光度E4。另一方面，胆固醇已知浓度的血清进行相同的操作，求出各吸光度E1std、E2std、E3std和E4std。
HDL胆固醇浓度从上述吸光度根据式(E2-E1)÷(E2std-E1std)×(已知HDL胆固醇浓度)求出。同样地，LDL胆固醇浓度也从上述吸光度根据式(E4-E3)÷(E4std-E3std)×(已知LDL胆固醇浓度)求出。
此外，使用其它各胆固醇的个别定量用市售试剂盒Determiner LHDL-C(协和梅迪克斯公司制造)和Determiner L LDL-C(协和梅迪克斯公司制造)，定量各样品中HDL胆固醇浓度、LDL胆固醇浓度。计算该市售试剂盒所得定量值和本发明方法所得定量值的相关系数，HDL胆固醇为0.997,LDL胆固醇为0.988。
图1表示本发明方法(图1中以DB HDL-C表示)所得的HDL胆固醇浓度和对照方法(L HDL-C方法，图1中S HDL-C表示)所得的HDL胆固醇浓度的相关性。此外，图2表示本发明方法(图2中以DB LDL-C表示)所得的LDL胆固醇浓度和对照方法(L LDL-C方法，图2中以S LDL-C表示)所得的LDL胆固醇浓度的相关性。实施例2(HDL胆固醇和LDL胆固醇的定量)试剂1(pH=7)MES(Nakalai Tesque公司制造)20mM磷钨酸(和光纯药公司制造) 7.5毫克/毫升硫酸镁(和光纯药公司制造) 1.5毫克/毫升TOOS(同仁化学公司制造) 0.5毫克/毫升EmulgenB66(花王公司制造)10毫克/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造)0.5毫克/毫升胆固醇酯酶(LPBP、旭化成公司制造)4U/毫升胆固醇氧化酶(rCO、Oriental酵母公司制造) 2U/毫升过氧化酶(东洋纺公司制造)10U/毫升试剂2(pH=7)MES(Nakalai Tesque) 50mM胆固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶、东洋纺公司制造)3U/毫升胆固醇氧化酶(协和发酵工业公司制造) 2U/毫升Pluronic L-121(旭电化公司制造) 0.7％Emulgen L-40(花王公司制造) 0.5％氯化钙(和光纯药公司制造)0.1毫克/毫升使用实施例1相同的样品，除测定波长为555nm外，其它同实施例1一样进行操作，定量HDL胆固醇和LDL胆固醇。计算市售试剂盒(上述Determiner L HDL-C和Determiner L LDL-C)所得定量值和本发明方法所得定量值的相关系数，HDL胆固醇为0.929,LDL胆固醇为0.911。实施例3(HDL胆固醇和总胆固醇的定量)试剂1(pH=7)MES(Nakalai Tesque) 20mM硫酸右旋糖酐(东京化成公司制造) 0.23毫克/毫升硫酸镁(关东化学社制造) 1.5毫克/毫升HDAOS(同仁化学公司制造) 0.23毫克/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造)0.13毫克/毫升聚乙二醇修饰的胆固醇酯酶(*1)0.25U/毫升聚乙二醇修饰的胆固醇氧化酶(*1) 1.65U/毫升过氧化酶12.5U/毫升*1和实施例1的*1一样调制*2和实施例1的*2一样调制试剂2(pH=6.75)MES(Nakalai Tesque)30mMTriton X-100(Sigma公司制造)1克/升胆固醇酯酶(东洋纺公司制造) 2.4U/毫升胆固醇氧化酶(天野制药公司制造) 6.25U/毫升作为样品，准备实施例1所用的健康人血清检30份，按下述操作定量HDL胆固醇和LDL胆固醇。
往2.25毫升试剂1中加入样30微升，搅拌，随后测定585nm的吸光度E1。接着在37℃下反应5分钟后，测定相同吸收波长的吸光度E2。往其中再加入0.75毫升试剂2，搅拌，随后测定585nm的吸光度E3。接着在37℃下反应5分钟后测定相同吸收波长的吸光度E4。另一方面，胆固醇已知浓度的血清进行相同的操作，求出各吸光度E1std、E2std、E3std和E4std。
HDL胆固醇浓度从上述吸光度根据式(E2-E1)÷(E2std-E1std)×(已知HDL胆固醇浓度)求出。同样地，总胆固醇浓度也从上述吸光度根据式(E4-E1)÷(E4std-Elstd)×(已知总胆固醇浓度)求出。
此外，使用其它各胆固醇的个别定量用市售试剂盒Determiner LHDL-C(协和梅迪克斯公司制造)和Determiner L TC Ⅱ(协和梅迪克斯公司制造)，定量各样品中HDL胆固醇浓度、总胆固醇浓度。计算该市售试剂盒所得定量值和本发明方法所得定量值的相关系数，HDL胆固醇为0.992，总胆固醇为0.999。
图3表示本发明方法(图3中DB-TC表示)所得的总胆固醇浓度(毫克/dL)和对照方法(Determiner L TCⅡ方法，图3中以LTC Ⅱ表示)所得的总胆固醇浓度(毫克/dL)的相关性。
图4表示本发明方法(图4中以DB HDL-C表示)所得的HDL胆固醇浓度(毫克/dL)和对照方法(LHDL-C方法，图4中S HDL-C表示)所得的HDL胆固醇浓度(毫克/dL)的相关。
将300微升第1试剂和4微升各样品混合，在37℃下保温5分钟。测定此时的吸光度，接着加入100微升第2试剂进行反应，测定5分钟后的吸光度。使用日立7070自动分析装置，主波长600nm，副波长700nm。
作为样品，用LDL组分所得反应前后的吸光度差为ALDL，用HDL组分所得反应前后的吸光度差为AHDL，用VLDL组分所得反应前后的吸光度差为AVLDL，用CM组分所得反应前后的吸光度差为ACM。
结果如表1所示。结果表示为AHDL/ALDL值、AVLDL/ALDL值和ACM/ALDL值。这些值越小就越表示为对LDL特异的定量条件。表1
如表1所示，表面活性剂组合使用与表面活性剂单独使用相比，胆固醇反应变为LDL胆固醇特异性。
结果如表2所示。
表2
如表2所示，表面活性剂组合使用与表面活性剂单独使用相比，胆固醇反应变为LDL胆固醇特异性。
结果如表3所示。表3
如表3所示，组合使用表面活性剂能够特异性测定LDL胆固醇。
结果如表4所示。表4
如表4所示，组合使用表面活性剂能够特异性测定LDL胆固醇。
结果如表5所示。表5
如表5所示，组合使用表面活性剂能够特异性测定LDL胆固醇。
结果如表6所示。表6
如表6所示，组合使用表面活性剂能够特异性测定LDL胆固醇。
另一方面，用市售的试剂盒Determiner L TC(协和梅迪克斯公司制造)测定总胆固醇，用デタミナHDL-C(协和梅迪克斯公司制造)测定HDL胆固醇，用Determiner LTC(协和梅迪克斯公司制造)测定中性脂肪，从下述的Friedewald公式求出LDL胆固醇浓度。计算本发明方法所得LDL胆固醇浓度和Friedewald公式求出的LDL胆固醇浓度的相关系数，为0.9767。
Friedewald计算式(LDL胆固醇浓度)=(总胆固醇浓度)-(HDL胆固醇浓度)-(中性脂肪浓度)图5表示本发明方法(图5中以本法表示)所得的LDL胆固醇浓度和对照方法(图5中以对照方法表示)所得的LDL胆固醇浓度的相关性。
工业实用性本发明提供了定量LDL胆固醇的方法和该方法所用的试剂盒。此外，本发明还提供了同一样品中HDL胆固醇和LDL胆固醇或总胆固醇在同一系统内连续分别定量的方法和该方法所用的试剂盒。
权利要求
1.一种机体样品中低密度脂蛋白--LDL--中的胆固醇--LDL胆固醇--的定量方法，其特征在于在a)机体样品、b)胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶--CH酶类--和c)使b)记载的CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂存在下，进行胆固醇的反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量LDL胆固醇的浓度。
2.根据权利要求1记载的定量方法，使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
3.根据权利要求2记载的定量方法，其中聚氧乙烯衍生物为聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基芳香醚。
4.根据权利要求2或3记载的定量方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为通式(Ⅰ)所示的表面活性剂HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整数。
5.一种机体样品中高密度脂蛋白--HDL--中胆固醇--HDL胆固醇--和LDL胆固醇的分别定量方法，其特征在于在a)机体样品、b)CH酶类和c)使b)记载的CH酶类只作用于HDL胆固醇的试剂存在下，进行第1次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量HDL胆固醇的浓度；接着d)加入使b)记载的CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂，进行第2次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量LDL胆固醇的浓度。
6.一种机体样品中HDL胆固醇和LDL胆固醇的分别定量方法，其特征在于在a)机体样品、b)CH酶类和c)使b)记载的CH酶类只作用于HDL胆固醇的试剂存在下，进行第1次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量HDL胆固醇的浓度；接着加入d)CH酶类和e)使b)记载的CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂，进行第2次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量LDL胆固醇的浓度。
7.根据权利要求5或6记载的定量方法，其中使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
8.根据权利要求7记载的定量方法，其中聚氧乙烯衍生物为聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基芳基醚。
9.根据权利要求7或8记载的定量方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为通式(Ⅰ)所示的表面活性剂HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整数。
10.一种机体样品中HDL胆固醇和总胆固醇的分别定量方法，其特征在于在a)机体样品、b)CH酶类和c)使b)记载的CH酶类只作用于HDL胆固醇的试剂存在下，进行第1次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量HDL胆固醇的浓度；接着d)往全部脂蛋白的胆固醇中加入使b)记载的CH酶类作用于全部脂蛋白中胆固醇的试剂，进行第2次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量总胆固醇。
11.一种机体样品中HDL胆固醇和总胆固醇的分别定量方法，其特征在于在a)机体样品、b)CH酶类和c)使b)记载的CH酶类只作用于HDL胆固醇的试剂存在下，进行第1次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量HDL胆固醇的浓度；接着往d)CH酶类和e)使d)记载的CH酶类作用于全部脂蛋白中胆固醇的试剂，进行第2次胆固醇反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶而定量总胆固醇。
12.根据权利要求5～11任一项记载的定量方法，其中使CH酶类只作用于HDL胆固醇的试剂为使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂。
13.根据权利要求12记载的定量方法，使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂还含有不溶解凝聚脂蛋白的非离子性表面活性剂。
14.根据权利要求12或13记载的定量方法，使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂为肝素或其盐、磷钨酸或其盐、硫酸右旋糖酐或其盐、聚乙二醇、硫酸环糊精或其盐、硫酸寡糖或其盐、或它们的混合物、与2价金属盐构成的试剂。
15.根据权利要求6或11记载的定量方法，第1次胆固醇反应所用的CH酶类为经化学修饰的酶，第2次胆固醇反应所用的CH酶类为没有经化学修饰的酶。
16.根据权利要求10～15任一项记载的定量方法，使CH酶类作用于全部脂蛋白中胆固醇的试剂含有溶解脂蛋白的表面活性剂。
17.CH酶类和使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂构成F的LDL胆固醇定量用试剂。
18.根据权利要求17记载的LDL胆固醇定量用试剂，其中使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
19.根据权利要求18记载的定量试剂，其中聚氧乙烯衍生物为聚氧乙烯烷基芳基醚。
20.根据权利要求18或19记载的LDL胆固醇定量用试剂，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为通式(Ⅰ)所示的表面活性剂，HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整数。
21.分别定量HDL胆固醇和LDL胆固醇的试剂盒，由第1试剂和第2试剂构成，第1试剂为含有使HDL脂蛋白以外的脂蛋白凝聚的试剂和CH酶类的试剂，第2试剂为含有使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂的试剂。
22.根据权利要求21记载的试剂盒，使CH酶类只作用于LDL胆固醇的试剂含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
23.根据权利要求21记载的试剂盒，其中聚氧乙烯衍生物为聚氧乙烯烷基芳基醚。
24.根据权利要求21或22记载的试剂盒，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为通式(Ⅰ)所示的表面活性剂HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整数。
25.分别定量HDL胆固醇和总胆固醇的试剂盒，由第1试剂和第2试剂构成，第1试剂为含有使HDL脂蛋白以外的脂蛋白凝聚的试剂和CH酶类的试剂，第2试剂为含有使CH酶类作用于全部脂蛋白中胆固醇的试剂的试剂。
26.根据权利要求25记载的试剂盒，其中使CH酶类作用于全部脂蛋白中胆固醇的试剂含有溶解脂蛋白的表面活性剂。
27.根据权利要求21～26任一项记载的试剂盒，使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂为肝素或其盐、磷钨酸或其盐、硫酸右旋糖酐或其盐、聚乙二醇、硫酸环糊精或其盐、硫酸寡糖或其盐、或它们的混合物、与2价金属盐构成的试剂。
全文摘要
本发明提供了低密度脂蛋白中胆固醇的定量方法及其所用的定量试剂。此外，本发明还提供了高密度脂蛋白中胆固醇和低密度脂蛋白中胆固醇的连续分别定量方法及其所用的试剂盒以及高密度脂蛋白中胆固醇和总胆固醇的连续分别定量方法及其所用的定量试剂盒。
文档编号G01N33/92GK1318107SQ99810984
公开日2001年10月17日 申请日期1999年7月30日 优先权日1998年9月18日
发明者杉内博幸 申请人:协和梅迪克斯株式会社