专利名称：低密度脂蛋白中胆固醇的定量方法
技术范围本发明涉及对动脉硬化症临床诊断很重要的低密度脂蛋白(LDL)中胆固醇(下面称为“LDL胆固醇”。本说明书中单独说“胆固醇”的时候包括酯型胆固醇和游离型胆固醇两者。)的分别定量方法。
背景技术：
LDL在血液中主要起着运输胆固醇的作用，在动脉粥样硬化中血管壁沉积的胆固醇主要是来源于LDL。血浆中LDL的增加是缺血性心脏病等粥样硬化性疾病的主要危险因子之一，所以LDL胆固醇的分别定量在临床上很有用。
传统的LDL胆固醇定量方法包括由分离操作和胆固醇定量操作两个步骤组成的方法，以及分别求出血中总胆固醇、HDL中的胆固醇和甘油三酯并根据Friedewald公式算出LDL胆固醇量的方法。
分离操作有超速离心法、沉淀法、免疫化学法等。使用超速离心法时，利用比重差以超速离心机分离LDL，然后测定胆固醇量。沉淀法是加入HDL抗体、多价阳离子和2价阳离子等，使之生产不溶性沉淀，定量离心分离所得上清中LDL胆固醇的方法(WPI Acc No.85-116848/20)。免疫化学法是将抗HDL、VLDL、CM的抗体结合于胶乳，凝集反应后用离心或过滤的方法除去胶乳，从而定量LDL胆固醇的方法(WPI Acc No.84-301275/49)。这些传统方法都有简便性和经济性的问题。
根据Friedewald公式，从总胆固醇中减去HDL胆固醇，再减去甘油三酯的1/5量，求出LDL胆固醇。但是，此方法受饮食和个体差异的影响，所以有正确性的问题。
此外，近年来报道有不需要分离操作的LDL胆固醇定量方法(WPIAcc No.83-766269/38)，但对LDL的特异性不高。
发明的公开本发明的目的在于提供无需复杂离心分离操作、能简便地分别定量LDL胆固醇的方法。
本发明者们发现，第一步先除去除低密度脂蛋白中胆固醇以外的胆固醇，第二步测定残留的胆固醇，能够定量低密度脂蛋白中的胆固醇，从而完成了本发明。
即，本发明提供了一种可能含有低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和/或乳糜微粒的被测样品中低密度脂蛋白的胆固醇的定量方法，它由除去被测样品中高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒中胆固醇的第一步骤和随后定量被测样品中残留胆固醇的第二步骤组成。
根据本发明，提供了无需复杂的离心分离操作，能够简便地分别定量LDL胆固醇的方法。
图的简单说明
图1表示在实施例1中LDL胆固醇的测定结果和Friedewald算出值的相关关系。
图2表示在实施例2中LDL胆固醇的测定结果和Friedewald算出值的相关关系。
图3表示在实施例4中，不存在及存在HDL、VLDL和CM的情况下LDL胆固醇浓度和根据本发明方法测定所得吸光度的相关关系。
发明实施的最佳形式作为脂蛋白中所含的胆固醇，有酯型胆固醇(胆固醇酯)和游离型胆固醇。在本说明书中，单独说“胆固醇”的时候同时包括二者。
作为用于本发明方法的被测样品，可以是可能含有HDL、LDL、VLDL和CM等脂蛋白的样品中的任一种，例如有血液、血清、血浆等体液及其稀释物，但并不仅限于此。
本发明的方法由第一步骤和第二步骤构成，在第一步骤中除去被测样品中HDL、VLDL和CM中的胆固醇，在随后的第二步骤中定量被测样品中残留胆固醇。因为在第一步骤中除去了HDL、VLDL和CM中的胆固醇，第二步骤定量的胆固醇主要是样品中LDL中的胆固醇。
第一步中的“除去”指的是分解胆固醇，而且其分解产物在随后的第二步中不被检出。作为选择性除去LDL以外的脂蛋白，即HDL、VLDL、CM等中所含的胆固醇的方法例如有以下的方法。
即，在作用于低密度脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂的存在下，用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶进行作用，除去产生的过氧化氢。
作为除去过氧化氢的方法，例如有用过氧化氢酶进行作用将其分解成水和氧的方法，以及使用过氧化物酶使酚类或苯胺类氢供体化合物和过氧化氢反应转化为无色醌类的方法，但并不仅限于此。
第一步反应液中的胆固醇酯酶浓度优选0.2～1.0U/毫升，作为其来源，优选假单胞菌属细菌产生的物质。此外，胆固醇氧化酶的浓度优选0.1～0.7U/毫升，优选使用细菌和酵母来源的物质。更进一步，过氧化氢酶的浓度优选40～100U/毫升。此外，过氧化氢转化为无色醌类时的过氧化物酶浓度优选0.4～1.0U/毫升，作为酚类或苯胺类氢供体化合物的浓度，优选0.4～0.8mmol/L。
作为第一步中所用的作用于LDL以外的脂蛋白的表面活性剂的优选例子，例如有HLB为13以上15以下、优选13以上14以下的聚氧化烯衍生物。作为衍生物的例子例如有高级醇缩合物、高级脂肪酸缩合物、高级脂肪酰胺缩合物、高级烷胺缩合物、高级烷基硫醇缩合物、烷基酚缩合物等。还有，表面活性剂的HLB计算方法众所周知，例如《新表面活性剂》(掘内博著、昭和61年、三共出版社)中记载的。
作为HLB值13以上15以下的聚氧化烯衍生物的优选具体例子，例如有聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鲸蜡醚、聚氧乙烯油醚、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等HLB值为13以上15以下的化合物，但并不仅限于此。
此外，作为第一步所用的表面活性剂，可以使用阳离子表面活性剂。作为此时的阳离子表面活性剂，优选下述一般式(I)所示的具有季铵盐作为亲水基团的物质。
其中式(I)中，R分别各自独立地表示碳数1～8的直链烷基，R1表示碳数3～20的烯基。
第一步中所用的上述表面活性剂的浓度优选0.1～10克/升左右，更优选0.5～5.0克/升左右。
第一步优选在pH5～8的缓冲液中进行，作为缓冲液优选Tris、三乙醇胺、Good’s等含有胺的缓冲液。特别优选作为Good’s的Bis-Tris、PIPES、MOPSO、BES、HEPES和POPSO缓冲液，缓冲液的浓度优选10～500mM。
在第一步中，为抑制和LDL的反应并提高其它脂蛋白的除去程度，反应液中可含有2价的金属离子。作为2价的金属离子，例如可以使用铜离子、铁离子和镁离子等，特别优选镁离子。2价金属离子的浓度优选5～200mM。
还有，在第一步的反应液中，可任意地加入脂蛋白分解酶。因特别可使VLDL中的胆固醇容易反应，优选加入这种酶。此酶在反应液中的浓度优选5.0～10.0U/毫升。
第一步的反应液温度优选25～40℃左右，最优选37℃。此外，反应时间可以是2～10分钟左右。
在随后的第二步中，定量被测样品中的残留胆固醇。例如可以通过至少加入作用于LDL的表面活性剂，定量如第一步中加入的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用生成的过氧化氢而进行。在这里，至少作用于LDL的表面活性剂可以是只选择性作用于LDL的表面活性剂，也可以是作用于所有脂蛋白的表面活性剂。
作为作用于所有脂蛋白的表面活性剂的优选例子，例如有HLB11以上不足13、优选12以上不足13的聚氧化烯衍生物。作为衍生物的例子，例如有高级醇缩合物、高级脂肪酸缩合物、高级脂肪酰胺缩合物、高级烷胺缩合物、高级烷基硫醇缩合物、烷基酚缩合物等。
作为HLB11以上不足13的聚氧化烯衍生物的优选例子，例如有聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鲸蜡醚、聚氧乙烯油醚、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等HLB11以上不足13的化合物，但并不仅限于此。
此外，作为仅选择性作用于LDL的表面活性剂，例如有阴离子表面活性剂。作为这里所用的阴离子表面活性剂，没有特殊的限定，优选芳香环上结合有碳数4～18的直链或支链烷基的物质。在这里，芳香环优选苯、萘、联苯等只由碳氢构成的物质。更优选上述芳香环中结合有如磺酸盐等亲水基团的物质。这样的优选阴离子表面活性剂的例子如下述式(II)～(VI)所示。
其中在式(II)～(VI)中，R分别各自表示碳数4～18的直链或直链烷基。此外，作为第二步中所用的优选阴离子表面活性剂，例如有高级醇硫酸钠等。
第二步所用的表面活性剂的浓度优选0.1～100克/升，更优选1～50克/升。
第二步的其它优选反应条件和第一步中的优选反应条件相同。
下面就基于实施例对本发明进行具体的说明。但本发明并不仅限于这些实施例。实施例1第1试剂BES缓冲液、pH6.0 100mmol/LHDAOSN-(2-羟基磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺 0.7mmol/L假单胞菌属细菌来源胆固醇酯酶(旭化成工业社制造，商品名“CEN”) 0.8U/毫升链霉菌属细菌来源胆固醇氧化酶(东洋纺织社制造，商品名“COO”)0.5U/毫升过氧化氢酶 80U/毫升氯化镁 10mmol/L花王社制造的Emulgen B66(聚氧乙烯衍生物(HLB＝13.2))0.2％第2试剂BES缓冲液、pH7.0 50mmol/L4-氨基安替比林 4.0mmol/L过氧化物酶 2.4单位/毫升叠氮化钠 0.1％花王社制造的Emulgen A60(聚氧乙烯衍生物(HLB＝12.8))5.0％分别将含有胆固醇浓度为100毫克/dl的精制HDL、LDL、VLDL、CM的各4微升样品和预先37℃加温的300微升第1试剂混合，在37℃下反应5分钟后，加入100微升第2试剂反应5分钟，测定600nm处的吸光度。从所测定的吸光度算出胆固醇量，并和样品中的胆固醇量相比算出捕捉率。结果如下表所示。表1
如表2所示，根据上述方法，当其它脂蛋白中的胆固醇基本不被捕捉而LDL中胆固醇的大部分可被捕捉，因此LDL中的胆固醇可以被选择地定量。实施例2第1试剂PIPES缓冲液、pH7.050mmol/LHDAOS 0.7mmol/L假单胞菌属细菌来源胆固醇酯酶(旭化成工业社制造，商品名“CEN”) 0.8U/毫升链霉菌属细菌来源胆固醇氧化酶(东洋纺织社制造，商品名“COO”) 0.5U/毫升过氧化氢酶80U/毫升氯化镁10mmol/L花王社制造的Emulgen B66 0.2％第2试剂PIPES缓冲液、pH7.050mmol/L4-氨基安替比林4.0mmol/L过氧化物酶2.4单位/升叠氮化钠 0.1％Triton×100 3.0％进行和实施例1相同的操作，求出各脂蛋白的反应性。结果如下表2所示。表2
实施例3试样使用健康人血清，进行实施例1、2的操作，求出LDL胆固醇浓度。作为对照方法，用Friedewald公式(CLIN.CHEM.、41、1414、1995)求出血清的LDL胆固醇浓度。其结果如图1和图2的相关图所示。
如图1和图2所示，根据两种方法定量的结果很一致，说明本发明的方法能够正确地定量LDL中的胆固醇。实施例4第1试剂Good’s缓冲液、pH7.050mmol/lHDAOS 0.7mmol/l胆固醇酯酶 0.8U/毫升胆固醇氧化酶0.5U/毫升过氧化氢酶 80单位/毫升阳离子表面活性剂(氯化月桂基三甲基铵)0.1％第2试剂4-氨基安替比林 4.0mmol/l过氧化物酶 2.4单位/毫升叠氮化钠0.1％非离子表面活性剂(聚氧乙烯月桂醚)0.1％(非离子表面活性剂在第2反应中使用)将20微升试样和180微升预先加热到37℃的第1试剂混合，在37℃下下反应5分钟后，加入60微升第2试剂，反应5分钟，在600nm下测定吸光度。
图3表示LDL胆固醇浓度和吸光度的关系，表明即使在HDL、VLDL和CM存在下也能够特异性且浓度依赖性地测定LDL胆固醇。
实施例5试样使用血清，进行实施例4的操作，求出LDL胆固醇浓度。作为对照方法，使用Friedewald公式(CLIN.CHEM.，41，1414，1995)求出血清中LDL胆固醇的浓度。其结果如表3所示。如表3所示，根据本发明方法的结果和根据Friedwald公式所得的结果具有良好的相关性。
权利要求
1.一种可能含有低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和/或乳糜微粒的被测样品中低密度脂蛋白中的胆固醇的定量方法，它由除去被测样品中高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒中胆固醇的第一步骤和随后定量被测样品中残留的胆固醇的第二步骤组成。
2.根据权利要求1记载的方法，其中的第一步骤是在作用于低密度脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂的存在下，用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶进行作用，除去生成的过氧化氢。
3.根据权利要求2记载的方法，上述第二步骤是往上述第一步骤的产物中加入至少作用于低密度脂蛋白的表面活性剂，定量上述胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用所生成的过氧化氢。
4.根据权利要求3记载的方法，上述至少作用于低密度脂蛋白的表面活性剂为作用于所有脂蛋白的物质。
5.根据权利要求1～4任一项记载的方法，上述第一步骤所用的作用于除低密度脂蛋白以外脂蛋白的表面活性剂为HLB值13以上15以下的聚氧化烯衍生物。
6.根据权利要求4记载的方法，上述第二步骤所用的作用于所有脂蛋白的表面活性剂为HLB值11以上13以下的聚氧化烯衍生物。
7.根据权利要求2记载的方法，上述第一步骤所用的作用于除低密度脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂为阳离子表面活性剂。
8.根据权利要求7记载的方法，上述阳离子表面活性剂为季铵盐。
9.根据权利要求3记载的方法，上述第二步骤所用的至少作用于低密度脂蛋白的表面活性剂为阴离子表面活性剂。
10.根据权利要求2～9任一项记载的方法，上述第一步骤中表面活性剂的浓度为0.1～10克/升。
11.根据权利要求6或9记载的方法，上述第二步骤中HLB值11以上13以下的上述聚氧化烯衍生物或上述阴离子表面活性剂的浓度为1～100克/升。
12.根据权利要求1～11任一项记载的方法，上述第一步骤和第二步骤在pH5～8的缓冲液中进行。
13.根据权利要求12记载的方法，上述缓冲液中含有胺。
14.根据权利要求1～13任一项记载的方法，上述第一和第二步骤在温度25～40℃下进行。
全文摘要
本发明公开了无需复杂离心操作、能够简单地分别定量LDL胆固醇的方法。本发明的低密度脂蛋白中胆固醇的定量方法由除去被测样品中高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒中胆固醇的第一步骤和随后定量被测样品中残留胆固醇的第二步骤构成。
文档编号G01N33/92GK1253627SQ97182112
公开日2000年5月17日 申请日期1997年10月13日 优先权日1997年4月14日
发明者松井宽史, 水野和重, 伊藤康树, 小原秀一, 藤原明, 高杉宪一, 冈田正彦 申请人:电化生研株式会社