专利名称：血清低密度脂蛋白胆固醇的定量测定试剂及测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及血清样品中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的定量测定试剂及试剂盒。
背景技术：
血清中的脂类物质如胆固醇和甘油三酯等并不是以游离形式存在于血清中，而是与各种载脂蛋白结合后以脂蛋白的形式存在于血清中，血清中的脂蛋白是颗粒状的物质， 根据颗粒的大小与密度可分为四类脂蛋白乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)，不同的脂蛋白在体内发挥不同的生理与病理功能， 上个世纪七十年代开始，众多的流行病学研究证实，血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与动脉粥样硬化或冠心病的发病率呈正相关，目前已公认低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 是冠心病的重要风险因子，因为LDL对动脉粥样硬化斑块的形成有极大的作用。Gottingen 的危险、发生率和流行病学研究(GRIP 表明，在所有的脂类和各种脂蛋白中，低密度脂蛋白胆固醇和冠心病死亡率之间呈现最强烈的相关。对低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量的测定是目前临床实验室普遍开展的工作。国际上测定低密度脂蛋白胆固醇的参考方法是β定量法，这一方法要使用能达到极大离心力的超速离心机，经长时间离心后除去极低密度脂蛋白(VLDL)，测定密度> 1.006 组份中的胆固醇含量，并从中减去高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量(密度> 1.063)，得到 LDL-C的含量。此法需要昂贵的设备超速离心机，操作复杂费时，处理样品的能力低下，无法在一般临床实验室开展对低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的测定。20世纪80年代发展出几种相对比较适合临床实验室使用的较为简单的测定 LDL-C的方法，这类方法的基本原理是以各种沉淀剂如高分子葡聚糖硫酸盐、多聚阴离子、 聚乙烯硫酸盐(PVS)、肝素等使血清中的LDL沉淀，离心分离沉淀物后，测定分离了 LDL后的样品上清液的胆固醇含量，同时测定原始血清样品的总胆固醇含量，从中减去前述分离了 LDL后的样品上清液的胆固醇含量，将其差值作为LDL-C的含量。这一类方法都不是对 LDL-C的直接测定，是间接测定方法。所以对同一样品至少要进行二次胆固醇含量测定才能得到LDL-C含量，而且由于有沉淀离心分离LDL的操作，因而无法实现自动化测定。这类方法对样品的处理能力也往往不能满足临床的需求，方法的精密度与准确度和特异性方面缺乏明显的优越性。由于沉淀法测定LDL-C的多种缺陷和使用不便，又有一种根据血清样品的总胆固醇含量(Tc)、甘油三酯含量(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)三者含量，以一个经验公式计算出LDL-C含量的方法，即Friedewald公式计算法。当一个血清样品的TC、TG和HDL-C 含量都在正常范围内，而且对上述三项脂类的测定都有较好的准确性时，根据Friedewald 公式计算得出的LDL-C含量一般也可认为是准确的；但Friedewald公式计算法不能适用于血脂异常尤其是高甘油三酯血症病人的血清样品，而临床上需要测定LDL-C的对象往往是有血脂异常的情况，如果对这些病人的血清样品以Friedewald公式计算法计算LDL-C含量，得到的结果对临床的诊断与治疗是没有意义的，而且很有可能对临床造成误导。
在20世纪90年代初曾短暂出现第二代的根据抗原-抗体免疫法原理的沉淀分离 LDL的方法，只是在沉淀法的甚而上对样品上用新的方法取代离心操作步骤，并无实质性的改进，这类方法也没有在国内推广使用。1998年首先由日本学者报告适合自动分析仪使用的勻相直接测定LDL-C的方法， 属第三代方法。此类方法的出现，为直接测定血清LDL-C开拓了一个崭新的思路，随之涌现了数种免去先分离LDL而可以在勻相体系中直接测定LDL-C的方法。其中一种是“增溶法”(Sol法)先用表面活性剂和糖化合物封闭非LDL脂蛋白(包括VLDL、CM和HDL)，然后在反应体系中用酶法测定LDL-C ；另一种是“表面活性剂法”(SUR法)在一种特殊的表面活性剂存在下，保护LDL-C不被反应体系中的酶水解，但其他脂蛋白所含的胆固醇被酶水解， 然后加入另一种特殊的表面活性剂，解除对LDL的保护，使LDL-C被酶水解后显色测定；第三种方法是“保护法”(PRO法)先用一种保护剂保护LDL不被酶催化反应，但其他脂蛋白所含的胆固醇被酶水解，然后加入去保护剂，解除对LDL的保护，使LDL-C被酶水解后显色测定；第四种方法是“紫外法”(CAL法)一种特殊的试剂与LDL结合形成可溶性聚合物，也不参与胆固醇的酶解反应，然后使LDL解聚，参与胆固醇的酶解反应，但是最后以脱氢酶途径利用辅酶I的转化以紫外光波长检测反应产物；再一种方法是选择性抑制法，用α-环糊精、硫酸葡聚糖和聚氧乙烯-聚丙烯封闭，共聚多糖抑制非LDL与胆固醇酶试剂的反应， 仅使LDL-C被酶水解并测定。这类勻相直接测定LDL-C的方法，适合自动化分析仪器进行测定，可以对临床大量检测样品进行快速测定，目前已普遍在各级医院的临床实验室中推广使用。目前，勻相直接测定LDL-C的市售试剂已打破了进口产品一统天下，已有不少国内的相关商品化试剂盒供应。经相关专利的检索，也检索到一些相关勻相直接测定LDL-C 的专利。但本专利申请的内容具有独立的特点，试剂性能更为优良，能有效抗干扰能力，价格更为低廉，为临床需要提供了一个较好的选择。
发明内容
在对消除法勻相直接测定LDLC的方法进行多年研究以及反复实验后，在以下几方面有了重大突破1、试剂中特殊的表面活性剂品种与分子量大小的选择非常重要，优选后的表面活性剂对在第一步酶反应中消除非LDL-C，保护LDL-C起到关键的作用，是本发明测定方法的技术关键。2、试剂中进行胆固醇水解反应的酶的来源、试剂中的浓度与相对比例的选择，是勻相直接准确测定样品LDL-C浓度的另一个关键因素。3、本法包含两次测定脂蛋白胆固醇的反应，虽然所采用的方法都是相同的胆固醇氧化酶的方法原理，但在第一步反应中分使胆固醇分解后不进行呈色反应，而第二步LDL 胆固醇的反应时，使胆固醇分解后进行呈色反应，最后可以通过比色测定。因此显色剂的选择、显色剂浓度的选择、和反应路径的设计对试剂与方法学而言是十分重要的。4、本试剂中的稳定剂并不特指某一个，其实有一种或多种试剂成分发挥了稳定剂的作用，对保持试剂的长期稳定，和抵抗多种明确的和不明确的干扰因素的影响发挥重要的作用。
本发明的目的之一是，提供一种以消除法原理代替沉淀法分离LDL，并可在勻相体系中直接自动分析测定样品中LDL-C含量的试剂，所述试剂由分别放置的试剂1和试剂2 组成，其中，所述试剂1中含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、4-氨基安替比林、过氧化氢酶、 特殊的表面活性剂、缓冲剂、和稳定剂等；所述试剂2中含有过氧化物酶、显色剂、另一种表面活性剂、以及稳定剂和缓冲剂。本发明的另一个目的是，提供一种直接定量测定血清样品中LDL-C含量的试剂盒，其中装有分别放置的前述试剂1和试剂2。本发明的再一个目的是提供一种在勻相体系中直接定量测定血清样品中LDL-C 含量的方法。具体而言，本发明用于勻相中直接定量测定血清样品中LDL-C含量的试剂盒由分别放置的试剂1和试剂2组成。其中，所述试剂1中含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、4-氨基安替比林、过氧化氢酶、特殊的表面活性剂、缓冲剂、和稳定剂等。所述试剂1的作用在于提供特殊的表面活性剂，保护LDL-C不被反应体系中的酶水解，但其他脂蛋白所含的胆固醇被酶水解。由于试剂1中仅含一种显色剂成分，并且有稳定剂的保护，所以试剂1在单独放置时是稳定的；且在样品测定时由试剂1提供反应所需的全部成分，但不合在反应时发生完全的呈色反应。如本文中使用的，术语“高纯度”是指产品的纯度大于95%。所述的特殊的表面活性剂选自苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚、硫酸葡聚糖等其中的一种或多种。特殊的表面活性剂在试剂溶液中的浓度可以根据使非LDL脂蛋白胆固醇完全分解的需求而定，其优选的浓度范围为500mg/L 10000mg/L，更为优选的浓度范围为 2000mg/L 5000mg/L。所述的使非LDL脂蛋白胆固醇完全分解的酶试剂包括胆固醇酯酶(CE)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化氢酶(Catalase)，其具体实例中，胆固醇酯酶(CE)选自由假单胞菌提取的高纯度制品，在试剂中的浓度范围为500U/L 15000U/L;胆固醇氧化酶(COD)选自由基因工程重组产品提取的高纯度制品，在试剂中的浓度范围为500U/L 15000U/L ；过氧化氢酶(Catalase)选自由曲霉菌提取的高纯度制品，在试剂中的浓度范围为1000U/L 30000U/L。所述的试剂1的具体实例中含有显色剂成分之一的4-氨基安替比林G-AAP)，其作用并不在第一反应次酶反应中发挥，而是留待在第二次酶反应中参与呈色反应。在具体实例中4-AAP的优选浓度范围为50mg/L 500mg/L。其中，本发明所述试剂2中含有含有过氧化物酶、显色剂、另一种表面活性剂、以及稳定剂和缓冲剂。所述试剂2的作用在于提供解除对LDL保护的另一种表面活性剂，使LDL-C在反应体系中仍存在的胆固醇酶法试剂的作用下可被分解。所述试剂2的另一作用在于提供的过氧化物酶(POD)与显色剂，使LDL胆固醇分解后产物与两种同时存在的显色剂反应，生成有色化合物，以供比色测定。所述的试剂2中含有的表面活性剂选自脂肪酸盐系列、磺酸盐系列的一种或多种，其具体实例可以选择十二烷基磺酸钠。在试剂溶液中的优选浓度范围为500mg/L 50000mg/L，更为优选的浓度范围为15000mg/L 25000mg/L。所述试剂2含有的过氧化物酶(POD)选自由辣根提取的高稳定性制品，其具体实例中，在试剂中的优选浓度范围为200U/L 50000U/L，更为优选的浓度范围为1000U/L 5000U/L。所述的试剂2含有的显色剂选自酚类化合物及其衍生物如苯酚、4-氯苯酚、N-乙基-N- (-2羟基-3-磺丙基)-间甲苯胺钠盐(TOOS)或者N-乙基-N- (-2羟基-3-磺丙基)-3，5_ 二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)等中的一种或多种，其具体实例中，选择N-乙基-N-(-2羟基-3-磺丙基)_间甲苯胺钠盐(TOOS)或者N-乙基-N-(-2羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)，呈色后有的灵敏度和较好的稳定性。显色剂在试剂溶液中的优选浓度范围为0. 5g/L 10. Og/L，更为优选的浓度范围为1. Og/L 3. Og/L。所述的试剂2还含有维持反应环境pH稳定的缓冲剂，选自GOODS缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种。其具体实例中，选择MOPS缓冲液的优选浓度范围为 0. 5mmol/L 200mmol/L，更为优选的浓度范围为30mmol/L 100mmol/L ；缓冲液的pH优选范围为5.0 8. 7。所述的试剂2含有的稳定剂选自四乙基乙二醇二钠盐(EDTA)，其在试剂溶液中的优选浓度范围为0. lg/L 10g/L。本发明所述以酶学方法在勻相体系中直接定量测定人血清样品中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量的试剂盒是将分别放置的上述试剂1和试剂2以不同的规格(ml)装入试剂盒包装中。该试剂盒具有多种不同的规格，可以分别适用于目前在临床实验室普遍使用的各种国内外品牌的自动生化分析仪器。本发明所述以酶学方法在勻相体系中直接定量测定人血清样品中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量的方法包括 规定血清样品与试剂1和试剂2的容积比例，其比例为样品试剂1 试剂2 =3 210 70。 测定操作的步骤为在反应容器中(一般为分析仪器的比色皿)先加入待测血清样品，再加入试剂1，混勻后在37°C的恒温环境中定时保温5分钟，使非LDL胆固醇在第一反应中分解，并在加入试剂2之前测定一定波长下的吸光度Al ；然后再加入试剂2起动第二次酶的反应，继续保温，在反应到达终点后，在上述相同的的波长处测定吸光度A2。用同样的方法测定校准液的吸光度Al与A2，血清样品中的LDL-C含量可通过下述的计算式得到LDL-C (mmol/L) = ( Δ A 测定 / Δ A 校准)X Cs (校准液 LDL-C 浓度)其中ΔΑ测定=样品测定的(Α2-Α1)，ΔΑ校准=校准品测定的(Α2-Α1)本发明的LDL-C测定方法只需3 10微升(μ )血清样品，总的反应体积也仅有 300 μ 1左右，检测的灵敏度以测定LDL-C的最低检测限(LLD)表示，至少可达0. lmmol/L, 所以是一种高效率、高灵敏度、低成本、快速微量的直接自动测定方法。附图简述
图1示出在实施例2中本发明试剂与对照试剂对LDL-C的测定结果。
具体实施方式
下面的实施例是对本专利申请的具体描述，但是，本专利申请不限于这些实施例， 这些实施例也不能解释为对本专利申请的限制。实施例1 一、按照下述成分和比例配制下述本发明试剂1及试剂2 试剂1
胆固醇酯酶1000 U/L
胆固醇氧化酶1000 U/L
过氧化氢酶30000 U/L
MOPS 缓冲液 pH7.035 mmol/L
NaOH0.5 g/L
硫酸葡聚糖2.0 g/L
叠氮化钠0.5 g/L
氯化镁2.0 g/L
4-氨基安替吡啉0.12 g/L
CHAPS4.0 g/L
BSA1.5 g/L
曲拉通 X-IOO1500 mg/L试剂2
过氧化物酶3000 U/L
MOPS 缓冲液 pH7.035mmol/L
NaOH0.5 g/L
EDTA0.2 g/L
BSA1.5 g/L
叠氮化钠0.5 g/L
TOOS1.8 g/L
曲拉通 X-IOO1500 mg/L
十二烷基横酸钠2000 mg/Lニ、測定使用HITACHI 7100型自动生化分析仪，设置分析參数具体为分析方 法终点法；测定点=16,34 ；检测波长:570nm(主)/700nm(副)；反应温度:37°C ；样品量 3.0ul ；试剂Rl 210 u 1 ；试剂R2 :70 u 1 ；反应方向上升；校准模式线性模式，2点校准； 単位mmol/L。仪器自动执行以下操作过程在比色皿中先加入待测血清样品3 iU，再加入试剂1 210 μ 1，混勻后在37°C的恒温环境中定时保温5分钟，读取吸光度Al ；然后再加入试剂2起动第二次酶的反应，继续保温，在反应到达终点时，读取吸光度A2。仪器自动根据计算公式LDL-C (mmol/L) = ( Δ A 测定 / Δ A 校准)X Cs (校准液 LDL-C 浓度)其中ΔΑ测定=样品测定的(Α2-Α1)，ΔΑ校准=校准品测定的(Α2-Α1)自动报告样品LDL-C的测定结果。对高、中、低三个LDL-C含量水平的血清样品进行测定，每份样品各以上述标准操作方法重复测定20次，按正规的统计学要求，求取每份样品测定结果的平均值和标准差， 然后按公式变异系数(CV% )=标准差/平均值X 100%计算变异系数CV%，结果列于下表1中。表1低浓度LDL-C测定的结果
权利要求
1.一种定量测定血清样品中低密度脂蛋白胆固醇含量的试剂，其适用于自动生化分析仪器进行自动定量测定低密度脂蛋白胆固醇，该试剂由分别放置的溶液型试剂1和试剂2 两部分组成，其中，所述试剂1中含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、4-氨基安替比林、过氧化氢酶、表面活性齐IJ、缓冲剂、和稳定剂；以及所述试剂2中含有过氧化物酶、显色剂、与试剂1中的表面活性剂不同的表面活性剂、 稳定剂、和缓冲剂。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂1中，所述的胆固醇酯酶选自由假单胞菌或牛胰腺提取的高纯度制品；所述的胆固醇氧化酶选自由诺卡氏菌、红曲霉菌、 假单胞菌、链霉菌、或基因工程重组产品提取的高纯度制品；所述的4-氨基安替比林选自高纯度制品；所述的过氧化氢酶选自由曲霉菌或牛肝细胞提取的高纯度制品。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂1中，所述的表面活性剂选自苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚和硫酸葡聚糖中的一种或多种；所述的缓冲剂选自GOODS缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种；所述的稳定剂选自曲拉通X系列和吐温系列的一种或多种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂，其特征在于，在所述试剂1中，所述的胆固醇酯酶在试剂溶液中的浓度范围为100U/L 20000U/L;所述的胆固醇氧化酶在试剂溶液中的浓度范围为500U/L 30000U/L ；所述的过氧化氢酶在试剂溶液中的浓度范围为200U/L 50000U/L ；所述的表面活性剂在试剂溶液中的的浓度范围为500mg/L 10000mg/L ；缓冲液的浓度范围为0. 5mmol/L 150mmol/L ；缓冲液的pH范围为5. 0 8. 7 ； 所述的稳定剂在试剂溶液中的浓度范围为500mg/L 50000mg/L ；所述的4-氨基安替比林在试剂溶液中的浓度范围为0. 05g/L 2. Og/L。
5.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂2中，所述的过氧化物酶选自由辣根提取的高稳定性制品，并且所述的过氧化物酶在试剂溶液中的浓度范围为200U/ L 50000U/L。
6.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂2中，所述的显色剂选自苯酚、 4-氯苯酚、N-乙基-N- (-2羟基-3-磺丙基)-间甲苯胺钠盐和N-乙基-N- (-2羟基-3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺钠盐中的一种或多种，并且所述的显色剂在试剂溶液中的浓度范围为 0. 5g/L 10. 0g/L。
7.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂2中，所述的表面活性剂选自脂肪酸盐系列、磺酸盐中的一种或多种，并且所述的表面活性剂在试剂溶液中的优选浓度范围为 500mg/L 50000mg/L。
8.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂2中，所述的缓冲剂选自 GOODS缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种，并且缓冲液的浓度范围为 0. 5mmol/L 200mmol/L ；缓冲液的pH优选范围为5. 0 8. 7。
9.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂2中，所述的稳定剂为四乙基乙二醇二钠盐，其在试剂溶液中的浓度范围为0. lg/L 10g/L。
10.一种定量测定血清样品中低密度脂蛋白胆固醇含量的试剂盒，其特征在于其中装有权利要求1至9中任一项所述的定量测定血清样品中低密度脂蛋白胆固醇含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂1和试剂2组成。
全文摘要
本发明提供了一种以酶学方法在匀相体系中直接定量测定人血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量的试剂，适用于自动生化分析仪器进行自动定量测定低密度脂蛋白胆固醇。该试剂由分别放置的溶液型试剂1和试剂2两部分组成，其中，试剂1中含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、4-氨基安替比林、过氧化氢酶、表面活性剂、缓冲剂、和稳定剂；试剂2中含有过氧化物酶、显色剂、另一种表面活性剂、以及稳定剂和缓冲剂。本发明还提供了一种无需对血清样品预处理而在匀相体系中直接测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量的方法，本发明还提供了一种适合临床实验室具体使用本发明方法的装有本发明试剂1和试剂2的试剂盒。
文档编号G01N33/52GK102539731SQ20121000509
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者宋高峰, 李清华 申请人:宁波天康生物科技有限公司