一种镍-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重金属离子的免疫学检测，具体涉及一种镍-低密度脂蛋白螯合物及 其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白质与脂质结合所形成的一种脂质-蛋白质复 合物，按密度分为高密度脂蛋白（high density lipoprotein，简称HDL)、中间密度脂 蛋白（intermediate density lipoprotein，简称 IDL)、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，简称 LDL)、极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,简称 VLDL)、 乳糜颗粒（chylomicron，简称CM) 〇
[0003] 血液中大约百分之三十的胆固醇是通过高密度脂蛋白从组织细胞中运输到肝脏 转化为胆汁酸或通过胆汁排出体外的。血液中约70%的胆固醇由LDL和VLDL所携带，而 LDL所携带的胆固醇含量大于VLDL，由于LDL富含胆固醇，因而被称为"坏胆固醇"。其与多 种疾病的发生、发展密切相关，特别是冠心病，糖尿病等疾病，研究发现LDL升高是动脉粥 样硬化发生、发展的必备条件。2014年，CELL REPORTS报道，"坏胆固醇"还可促进癌症细 胞的发展和转移。
[0004] LDL是动脉粥样硬化发生和发展的主要危险因素，其改变在血清蛋白中有很强的 影响动脉粥样硬化作用，是冠状动脉疾病的重要危险因子，与心血管疾病危险程度呈正相 关。因而定量检测血清中LDL对于心血管疾病具有重要意义，不仅可以用于早期识别动 脉粥样硬化的危险性，而且可以作为降脂药物治疗过程的检测以及预后评价的指标之一。 此外，其他一些疾病，诸如：肾病综合征、慢性肾功能衰竭、肝病及糖尿病等，也可使血清中 LDL含量上升，而定量检测LDL也可用于这些疾病的早期诊断以及治疗效果监测，甚至作为 预后好坏的评价指标之一。而对于营养不良、慢性贫血、骨髓瘤、急性心肌梗死、创伤和严重 肝病等患者，血清LDL的含量将会下降，定量检测LDL也可用于这些疾病的早期诊断、治疗 效果监测以及作为预后评价的指标之一。
[0005] 镍（Nickel，Ni)与人体的健康息息相关，首先其是人体维持健康所必需的微量元 素，其存在于多种氢化酶中，催化氢的氧化还原反应，参与多种酶蛋白的合成和细胞激素及 色素的代谢，具有促进铁的吸收和红细胞的增长、激活酶形成辅酶、增强胰岛素、降血糖、保 护心血管等作用，因此如果人体缺乏镍，会导致疾病的发生。但是，事实在生活中，由于环境 污染，人体内很少缺乏镍，相反镍的含量常常过量，常常导致疾病的发生，甚至危及生命。
[0006] 然镍螯合于低密度脂蛋白上的机制尚不清楚，两者之间的相互作用及对机体的影 响也尚待研究。但是可以明确的，低密度脂蛋白和镍对于机体的作用都至关重要，而定量检 测低密度脂蛋白上螯合镍是研究两者相互关系的第一步，其具有重要科研及临床价值。
【发明内容】
[0007] 针对镍污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种镍-低密度脂蛋白螯合物及 其制备方法，并建立镍-低密度脂蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测镍-低 密度脂蛋白螯合物在评价一个地区镍污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中 镍-低密度脂蛋白螯合物，可以间接反映这个地区人群受镍污染的情况，从而间接反映这 个地区镍污染程度。
[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种镍-低密度脂蛋白螯合 物，该镍-低密度脂蛋白螯合物是镍离子与低密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯 合而成。
[0009] 本发明还提供一种上述的镍-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，即体外合成法， 包括以下步骤：
[0010] A)镍-低密度脂蛋白螯合物的合成：在提纯源于人体的低密度脂蛋白或按照生物 学方法重组的低密度脂蛋白中加入镍离子进行螯合反应，得到反应溶液；
[0011] B)镍-低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中 未反应的低密度脂蛋白、特异性抗体和镍离子，即得镍-低密度脂蛋白螯合物。
[0012] 作为优选，所述步骤B)中具体包括以下步骤：
[0013] (1)溶解样品：将上述步骤A)的镍-低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中，得 镍-低密度脂蛋白螯合物溶液；
[0014] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与低密 度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0015] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使低密 度脂蛋白与填料特异性结合；
[0016] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. 10m〇l/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0017] (5)收集：收集步骤（4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0018] (6)透析：将步骤（5)的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次后，4°C透 析过夜，收集样本；
[0019] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与镍特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0020] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0021] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0022] (10)收集：收集步骤（9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0023] (11)透析：将步骤（10)的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次后，4°C 透析过夜，收集样本，即得镍-低密度脂蛋白螯合物。
[0024] 作为优选，上述镍-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，还包括以下对镍-低密度脂 蛋白螯合物的鉴定步骤，具体包括以下步骤：
[0025] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0026] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的镍_低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲 液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0027] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0028] (4)检测：在胶床上找出含有镍的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶 解，然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有镍以及检测镍的含量。
[0029] 本发明还提供一种如上述的镍-低密度脂蛋白螯合物在制备检测人体内镍-低密 度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
[0030] 本发明还提供一种至少包括如上述的镍-低密度脂蛋白螯合物作为标准品的试 剂盒。
[0031] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获低密度脂蛋白的蛋白或捕 获金属镍的物质。
[0032] 本发明还提供一种定量检测镍-低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述 的镍-低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、 酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯镍-低 密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯镍-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合 法、提纯镍-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原 子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
[0033] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0034] 1.本发明首次合成了镍-低密度脂蛋白螯合物；
[0035] 2.本发明首次提出镍-低密度脂蛋白螯合物可用于制备检测血样中镍-低密度脂 蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用；
[0036] 3.本发明实现了螯合型低密度脂蛋白的特异性识别和定量检测，以便定量检测人 群血清中镍-低密度脂蛋白螯合物的含量，以评价一个地区镍污染程度的应用，为工业地 区的镍污染水平提供间接指标。本发明建立的镍-低密度脂蛋白螯合物定量检测方法的 准确度高、重复性好。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明所述的镍-低密度脂蛋白螯合物的非变性电泳条带图；
[0038] 图2为本发明所述的镍-低密度脂蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分 析图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0040] 本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤；所用试剂、材 料如未特殊说明，均视为可从市购方式购得：
[0041] 提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0042] 捕获低密度脂蛋白的蛋白为抗低密度脂蛋白抗体，可通过市售获得，如货号为 "Abeam abl57795"的anti-LDL抗体，以下实施方式中，所述与低密度脂蛋白特异性结合的 物质、抗低密度脂蛋白抗体、抗LDL抗体均为捕获低密度脂蛋白的蛋白；
[0043] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0044] 稀释缓冲液为pH 9. 6的0. 05M碳酸盐缓冲液，配制方法示例：取1. 5g的似20)3和 2. 93g 的 NaHC03溶解加 ddH20 定容至 1000mL ;
[0045] 洗涤缓冲液为pH7. 4的0. 15M PBS溶液，配制方法示例：取0. 2g的KH2P04 2 . 90g 的 Na2HP04 ? 12H20、8. 0g 的 NaCl、0. 2g 的 KC1、0. 5mLTween-20,溶解加 ddH20 定容至 1000mL ;
[0046] 封闭液为牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0. lg牛血清白蛋白，加入洗涤缓 冲液稀释定容至l〇〇mL ;
[0047] 终止液为2M H2S04，配制方法示例：取178. 3mL的ddH20,加浓H2S04定容至200mL ;
[0048] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液，配制方法示例：取0. 5mL浓度为2g/L的甲基联苯 胺乙醇溶液，加底物稀释液稀释至10mL ;
[0049]底物缓冲液pH为5. 0，其中Na2HP04的摩尔浓度为0. 2M、柠檬酸的摩尔浓度为 0. 1M，配制方法示例：取