作用2小时，使其与抗Ni抗体反应；
[0212] (4)洗脱：移去酶标抗体，用稀释缓冲液对洗脱液进行稀释，使洗脱液中木瓜蛋白 酶的浓度：酶标抗体中抗体的浓度=1:80、1:40、1:20、1:10、1:5，分别放置于37°C温度下 作用lh、2h、3h ;移去洗脱液，洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37°C避光作用30分钟；
[0213] (5)于450nm的检测波长下在酶标仪上分别读取每个微孔的0D值，具体结果参见 表4，
[0214] 表4不同洗脱液稀释倍数下的检测结果
[0215]
[0216] 通过比较0D值，以判断ELISA孔壁上结合的抗Ni抗体-酶标抗体复合物洗脱程 度，当0D值最低时，抗Ni抗体-酶标抗体复合物洗脱程度达到最大。如表4所示，当洗脱 液中木瓜蛋白酶的浓度：酶标抗体中抗体的浓度=1:20时，洗脱程度最高；而作用时间为 lh、2h、3h时，各组0D值变化不大，可见随着时间的延长，酶活力逐渐减弱，在酶浓度不变的 情况下，延长消化时间并不能提高消化率，所以本实验中洗脱液的作用时间为l_3h皆可， 综上所述，我们选择洗脱液1:20作为最适工作浓度，l-3h作为最适洗脱时间。
[0217] 应用实施例
[0218] 应用实施例1
[0219] 采用全血提取法提取出镍-低密度脂蛋白螯合物，采用酶联免疫法（ELISA法）检 测100份标本血浆中的镍-低密度脂蛋白螯合物，即采用具体实施例方法一记载的方法检 测，具体操作步骤如下：
[0220] 1)包被：将抗低密度脂蛋白抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释至500倍， 加入ELISA板微孔中，37°C保存1小时后于冰箱中4°C储存；
[0221] 2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，洗涤， ELISA板37°C放置1小时后于冰箱中4°C储存；
[0222] 3)加样：以标本血浆作为待测样本，以已知含量的镍-低密度脂蛋白螯合物作标 准品，用稀释缓冲液将待测样本和标准品均稀释至10倍，加入微孔中，37°C作用1小时；
[0223] 4)加二抗：移去样品，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释至5000倍的抗Ni抗体，37°C 作用1小时，使其与低密度脂蛋白上的金属镍反应；
[0224] 5)加酶标：移去抗Ni抗体，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释至抗体浓度为2 yg/mL 的酶标抗体，37°C作用1小时，使其与抗Ni抗体反应；
[0225] 6)底物温育：移去酶标抗体，洗涤，加入底物，37°C避光作用30min，滴加入终止 液；
[0226] 7)检测：于450nm波长下在酶标仪上分别读取待测样本和标准品的0D值，结果如 表5所示。
[0227] 表5方法一对100份标本血浆的实测结果
[0228]
[0229] 本应用实施例1中，步骤7)中，也可以不使用酶标仪检测，而是直接通过染色进行 定性检测。
[0230] 应用实施例2
[0231 ] 采用酶联免疫与原子吸收光谱结合法（ELISA法+AAS法）检测100份标本血浆中 镍-低密度脂蛋白螯合物，即采用具体实施例方法二记载的方法检测，具体操作步骤如下：
[0232] 1)包被：将抗低密度脂蛋白抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释包被蛋白 至500倍，加入ELISA板微孔中，4°C过夜18小时；
[0233] 2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，洗涤， ELISA板4°C下保存；
[0234] 3)加样：以标本血浆作待测样本，以已知含量的镍-低密度脂蛋白螯合物作标准 品，用稀释缓冲液将待测样本和标准品稀释至20倍，加入微孔中，37°C作用1小时；
[0235] 4)洗脱：移去待测血浆样本，洗涤，加入0? 8mol/L的Na2HP04溶液，37°C作用2小 时；
[0236] 5)检测：从ELISA微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于低密度脂蛋白上的 镍，结果如表6所示。
[0237] 表6方法二对100份标本血浆的实测结果
[0238]
[0239] 应用实施例3:
[0240] 采用酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法（ELISA法+ICP-MS法）检测100 份标本血浆中镍-低密度脂蛋白螯合物，即采用具体实施例方法三记载的方法检测，具体 操作步骤如下：
[0241] 1)包被：将抗低密度脂蛋白抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释包被蛋白 至500倍，加入ELISA板微孔中，4°C保存18小时；
[0242] 2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，洗涤， ELISA板4°C保存；
[0243] 3)加样：以标本血浆作待测样本，以已知含量的镍-低密度脂蛋白螯合物作标准 品，用稀释缓冲液将待测样本和标准品稀释至10倍，加入微孔中，37°C作用2小时；
[0244] 4)洗脱：移去待测样本和标准品，洗涤，加入0? 8mol/L的Na2HP04溶液，37°C洗脱 2小时；
[0245] 5)酸化：在溶液中加入硝酸对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化，加入过氧化 氢，并且加热赶酸；
[0246] 6)检测：取样，于电感耦合等离子体质谱仪下检测螯合于低密度脂蛋白上的镍， 结果如表7所不。
[0247] 表7方法三对100份标本血的实测结果
[0248]
[0249] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围， 本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所 要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种镍-低密度脂蛋白螯合物，其特征在于，该镍-低密度脂蛋白螯合物是镍离子与 低密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。2. 制备如权利要求1所述的镍-低密度脂蛋白螯合物的方法，包括以下步骤： A) 镍-低密度脂蛋白螯合物的合成：在提纯源于人体的低密度脂蛋白或按照生物学方 法重组的低密度脂蛋白中加入镍离子进行螯合反应，得到反应溶液； B) 镍-低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中未反 应的低密度脂蛋白、特异性抗体和镍离子，即得镍-低密度脂蛋白螯合物。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于， 所述步骤B)中具体包括以下步骤： (1) 溶解样品：将上述步骤A)的镍-低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中，得镍-低 密度脂蛋白螯合物溶液； (2) 平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与低密度脂 蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱； (3) 上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使低密度脂 蛋白与填料特异性结合； (4) 洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. lOmol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱； (5) 收集：收集步骤（4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原； (6) 透析：将步骤（5)的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后，4°C透析过 夜，收集样本； (7) 平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与镍 特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱； (8) 上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱； (9) 洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的Na2HPO4 溶液进行洗脱； (10) 收集：收集步骤（9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原； (11) 透析：将步骤（10)的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后，4°C透析 过夜，收集样本，即得镍-低密度脂蛋白螯合物。4. 根据权利要求2所述的镍-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，其特征在于，步骤B) 后还包括步骤C):对镍-低密度脂蛋白螯合物的鉴定； 其中，步骤C)中具体包括以下步骤： (1) 制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床； (2) 加样：取步骤B)中提取纯化得到的镍-低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲液，并 混匀，然后加样于样品槽中； (3) 电泳：连接电泳板，进行电泳； (4) 检测：在胶床上找出含有镍的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解，然 后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有镍以及检测镍的含量。5. -种如权利要求1所述的镍-低密度脂蛋白螯合物在制备检测血样中镍-低密度脂 蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。6. -种至少包括如权利要求1所述的镍-低密度脂蛋白螯合物作为标准品的试剂盒。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括包被液，该包被液含有捕获低密 度脂蛋白的蛋白或捕获金属镍的物质。8. -种定量检测镍-低密度脂蛋白螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的权利要 求1所述的镍-低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联 免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯 镍-低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯镍-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光 谱结合法、提纯镍-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免 疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
【专利摘要】本发明提供一种镍-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用，该镍-低密度脂蛋白螯合物是镍离子与低密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成，可用于制备检测人体镍-低密度脂蛋白螯合物的试剂。本发明首次证实了镍离子可直接作用于低密度脂蛋白。本发明建立了镍-低密度脂蛋白螯合物的定性定量检测方法，以检测一个地区人群体内低密度脂蛋白的含量，从而间接反映一个地区镍污染程度以及对人群的健康影响。本发明建立的镍-低密度脂蛋白螯合物定量检测方法准确度高重、复性好。
【IPC分类】G01N33/96, C07K1/22, C07K14/775, G01N33/92
【公开号】CN105037528
【申请号】CN201510412254
【发明人】张积仁, 阳帆, 董欣敏, 吴婧, 蔡睿, 孙遥, 赵乙木
【申请人】上海拜豪生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月14日