，待洗涤完成后，加入封闭 液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤缓冲液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于 37 °C放置1小时；
[0103] 3)加待测样本，并且温育：从循环系统中取样，作待测样本；以已知含量的镍-低 密度脂蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释至10-40倍，加入微孔中，37°C作用1-2小 时；
[0104] 4)洗脱：移去待测样本，洗涤，加入洗脱液，在37°C下洗脱1-3小时；
[0105] 5)检测：从ELISA微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于低密度脂蛋白上的 镍，读出相应数值；
[0106] 该实施例利用ELISA原理对低密度脂蛋白进行捕获，并结合原子吸收光谱（AAS) 仪检测螯合于低密度脂蛋白上的镍；由于溶液中仅含有低密度脂蛋白，且所用试剂中不含 任何重金属（阴性对照组结果为阴性），不会对结果造成干扰，因而当所读取的结果显示为 阳性时，即可证明检测出低密度脂蛋白上螯合的金属镍。
[0107] 方法三：酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法（ELISA法+ICP-MS法）检测 镍-低密度脂蛋白螯合物按照如下步骤检测：
[0108] 1)包被：将能够捕获低密度脂蛋白的蛋白，如抗低密度脂蛋白抗体包被于固相载 体上，用稀释缓冲液稀释抗低密度脂蛋白抗体至250-2000倍，加入ELISA板微孔中，4°C过 夜16-18小时，或37°C水浴1-3小时，储存冰箱；
[0109] 2)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入封闭 液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤缓冲液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于 37 °C放置1小时；
[0110] 3)加待测样本，并且温育：从循环系统取全血，作待测样本；以已知含量的镍-低 密度脂蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释至10-40倍，加入微孔中，37°C作用1-2小 时；
[0111] 4)洗脱：移去待测样本，并用相应洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入洗脱 液，在37°C下洗脱1-3小时；
[0112] 5)酸化：在步骤4)中的溶液中加入酸化剂对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸 化；
[0113] 6)检测：加入过氧化氢，并且加热赶酸，并从ELISA试剂板中洗脱的溶液中取 〇.5mL液体，于电感耦合等离子体质谱仪下检测螯合于低密度脂蛋白的镍，读出相应数值。
[0114] 该方法在利用ELISA原理的基础上，结合感耦合等离子体质谱（ICP-MS)原理，用 电感耦合等离子体质谱仪检测螯合于低密度脂蛋白上的镍；即先采用ELISA原理将血清中 的镍-低密度脂蛋白螯合物提取出来，再采用感耦合等离子体质谱仪对螯合于低密度脂蛋 白上的镍进行定量检测；由于溶液中仅含有低密度脂蛋白，且所用试剂中不含任何重金属 (阴性对照组结果为阴性），不会对结果造成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即 可证明检测出低密度脂蛋白上螯合的金属镍。
[0115] 方法四：提纯镍-低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法(提纯法+ELISA法）检 测镍-低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
[0116] 1)从全血中提取非特异性低密度脂蛋白：采用超速离心法、高压液相层析法、凝 胶过滤层析法、凝胶电泳法等方法，从全血中提取低密度脂蛋白，并将提取出的低密度脂 蛋白复溶，得低密度脂蛋白的溶液；
[0117] 2)包被：将抗镍抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释抗镍抗体至 2500-20000倍，加入ELISA板微孔中，4°C过夜16-18小时，或37°C水浴1-3小时，储存冰 箱；
[0118] 3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入封闭 液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤缓冲液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于 37 °C放置1小时；
[0119] 4)加待测样本，并且温育：从步骤2)的溶液中取样，作待测样本；以已知含量的 镍-低密度脂蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释至10-40倍，加入微孔中，37°C作用 1-2小时；
[0120] 5)酶结合物温育：移去待测样本，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入 用稀释缓冲液稀释的酶标抗体，37°C作用1-2小时，使其与酶标抗体反应；
[0121] 6)底物温育：移去酶标抗体，并用相应洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入 底物，37°C避光作用30分钟；
[0122] 7)终止反应：滴加终止液至每一微孔；
[0123] 8)取波长450nm，加完终止液后，在酶标仪上分别读取待测样本组和标准品的0D 值，绘制标准曲线，通过与标准品组比较，求得待测样本的含量。
[0124] 本方法中，步骤8)中，也可不使用酶标仪，直接通过染色情况进行定性检测。
[0125] 方法五：提纯镍-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法（提纯法+AAS法） 检测血样中镍-低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
[0126] 1)从全血中提取非特异性低密度脂蛋白：采用超速离心法、高压液相层析法、凝 胶过滤层析法、凝胶电泳法等方法，从全血中提取低密度脂蛋白，并将提取出的低密度脂蛋 白复溶，得低密度脂蛋白的溶液；
[0127] 2)检测：从步骤1)的溶液中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于低密度脂蛋白上 的镍，读出相应数值。
[0128] 方法六：提纯镍-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法（提纯法 +ICP-MS法）检测镍-低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
[0129] 1)从全血中提取非特异性低密度脂蛋白：采用超速离心法、高压液相层析法、凝 胶过滤层析法、凝胶电泳法等方法，从全血中提取低密度脂蛋白，并将提取出的低密度脂 蛋白复溶，得低密度脂蛋白的溶液；
[0130] 2)酸化：从步骤1)的溶液中取样，在溶液中加入硝酸对溶液进行酸化，封口过夜， 彻底酸化；
[0131] 3)检测：加入过氧化氢，并且加热赶酸后取0. 5mL溶液，于电感耦合等离子体质谱 仪下检测螯合于低密度脂蛋白上的镍，读出相应数值。
[0132] 方法四、方法五和方法六均是通过全血提取法分离出低密度脂蛋白，再采用特异 性检测方法，测定低密度脂蛋白中镍-低密度脂蛋白螯合物上镍的含量；即先采用物理分 离手段，如超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法等，将低密度脂蛋白从待测血浆 样本中分离出来并复溶于生理盐水中，再利用ELISA原理、原子吸收光谱检测或进行检测 电感耦合等离子体质谱法检测镍-低密度脂蛋白螯合物上的镍含量。
[0133] 方法七：电泳法+ELISA/AAS/ICP-MS法检测镍-低密度脂蛋白螯合物，具体如下：
[0134] 1)从全血中提取非特异性低密度脂蛋白：采用超速离心法、高压液相层析法、凝 胶过滤层析法、凝胶电泳法等方法，从全血中提取低密度脂蛋白，将提取出来的低密度脂蛋 白复溶于生理盐水中，得低密度脂蛋白的溶液；
[0135] 2)制备胶床：根据需要选择合适的介质（如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等），按 照相应要求制备好相应胶床；
[0136] 3)加样：从步骤1)的溶液中取8yL，以已知含量的镍-低密度脂蛋白螯合物作标 准品，加入2yL上样缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0137] 4)电泳：连接电泳板，加电泳缓冲液，进行电泳，并根据需求将蛋白按照分子量、 等电点等参数的不同进行分离；
[0138] 5)检测：在胶床上找出含有镍的蛋白条带，将该条带取出，将该蛋白条带溶解，然 后再分别利用ELISA、ICP-MS或AAS等原理检测是否含有镍以及镍的含量。
[0139] 此外，还可以利用此方法检测镍-低密度脂蛋白螯合物的等电点、分子量及含量 等。
[0140] 在方法七中，将低密度脂蛋白从全血中提取出来，再采用凝胶电泳法对所提取的 低密度脂蛋白进行分离，再找出富含镍的相应条带，再检测相关低密度脂蛋白的含量；即低 密度脂蛋白可以用多种方法提纯出来（例如超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析 法、凝胶电泳法，ELISA方法等），将提纯出来的低密度脂蛋白复溶，取一定量的低密度脂蛋 白，利用电荷移动原理，进行电泳（electrophoresis，EP)，在凝胶板（可根据需要采用不同 介质）上可根据分子量、等电点等不同跑出不同的条带，寻找出富含镍的相应条带，将凝胶 中的蛋白质复溶，即可以在特定波长下检测相关低密度脂蛋白的含量，也可以利用ELISA、 AAS、ICP-MS等原理检测出螯合于低密度脂蛋白上的镍含量，由于溶液中仅含有低密度脂蛋 白，且所用试剂中不含任何重金属（阴性对照组结果为阴性），不会对结果造成干扰，因而 当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出低密度脂蛋白上螯合的金属镍。
[0141] 实施例1:合成法合成镍_低密度脂蛋白鳌合物，即包括以下步骤:
[0142] 本实施例所制备的镍_低密度脂蛋白鳌合物，通过凝胶电泳进一步分离，并通过 电感耦合等离子体质谱或原子吸收光谱进行检测定性鉴定。
[0143] 本实施例使用的试剂的配制方法如下：
[0144] 1)硼酸盐缓冲液，其摩尔浓度为0. 01M，其制备方法如下：称取0. 31g硼酸溶于 400mLddH20 中，用 0? lmol/L 的 NaOH 调节 pH 至 9. 0,定容至 500mL。
[0145] 2) EDTA_NaHC03溶液，其制备方法如下：取 1. 86g EDTA ? 2H 20 和 16. 8g NaHC03,溶 于900mLddH20中，用1. 0M NaOH调整pH至8. 0定容至1000mL，高压灭菌，室温保存；
[0146] 3) ITCBE购买自日本同仁化学研究所，货号M030 ;
[0147] 4)低密度脂蛋白溶液：称取4. Omg低密度脂蛋白溶于4. OmL0.0 1M pH9. 0硼酸盐 缓冲液中，充分振荡溶解，配制成1. Omg/mL的低密度脂蛋白溶液；
[0148] 5)透析袋的截留分子量14000,购买自Bioshop Inc ;
[0149] 透析袋的预处理：将透析袋放入500mL的EDTA_NaHC03溶液中，煮沸10min ;倾弃 EDTA-NaHC(V?^)f，用ddH20轻轻漂洗，再用500mL5mmol/L EDTA煮沸10min ;弃掉煮沸液，彻 底