用ddH20清洗，加入大量的ddH20浸泡透析袋4°C过夜。使用时，戴上手套，取出透析袋， 用大量的ddH 20彻底冲洗其内外表面；
[0150] 制备镍-低密度脂蛋白螯合物的方法，包括以下步骤：
[0151] A)镍-低密度脂蛋白螯合物的合成：在提纯源于人体的低密度脂蛋白或按照生物 学方法重组的低密度脂蛋白中加入镍离子进行螯合反应，得到反应溶液，具体包括以下步 骤：
[0152] 1)取 2. Omg ITCBE 溶于 2mLDMS0 中；
[0153] 2)缓慢将步骤1制备的液体加入低密度脂蛋白溶液中，边滴加边震荡，于25°C， 100r/min的摇床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未与低密度脂蛋白结合的 ITCBE ；
[0154] 3)将透析所得的液体用lmol/L HC1调节pH值至7. 0,然后缓慢逐渐滴加80 y 1 lmmol/L镍离子溶液，边滴加边振荡，以免镍离子使蛋白变性沉淀；
[0155] 4)将加好的溶液在25°C，100r/min的摇床中反应2h，用处理好的透析袋进行透析 24h ；
[0156] 5)将透析好的液体于_20°C分装保存，得到镍-低密度脂蛋白螯合物。
[0157] B)镍-低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中 未反应的低密度脂蛋白、特异性抗体和镍离子，即得镍-低密度脂蛋白螯合物，具体包括以 下步骤：
[0158] (1)溶解样品：将上述步骤A)的镍-低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中，得 镍-低密度脂蛋白螯合物溶液；
[0159] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与低密 度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0160] 所述能与低密度脂蛋白特异性结合的填料为吸附有可与低密度脂蛋白特异性结 合物质的硅胶或树脂；
[0161] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使低密 度脂蛋白与填料特异性结合；
[0162] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. 10m〇l/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0163] (5)收集：收集步骤（4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0164] (6)透析：将步骤（5)的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次后，4°C透 析过夜，收集样本；
[0165] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与镍特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0166] 所述能与镍特异性结合的填料为吸附有可与镍特异性结合物质的硅胶或树脂；
[0167] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0168] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0169] (10)收集：收集步骤（9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0170] (11)透析：将步骤（10)的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次后，4°C 透析过夜，收集样本，即得镍-低密度脂蛋白螯合物。
[0171] C)对镍-低密度脂蛋白鳌合物的鉴定，具体步骤如下：
[0172] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶作为介质制备胶床；
[0173] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的镍_低密度脂蛋白螯合物，复溶于生理盐 水中，得镍-低密度脂蛋白螯合物的溶液，取8 y L上述溶液，加入2 y L上样缓冲液，并混 匀，然后加样于样品槽中；
[0174] (3)电泳：连接电泳板，加电泳缓冲液进行电泳；电泳过程中，电流为22mA恒流，环 境温度为4度；至溴酚蓝移至胶底部时停止电泳，图1为本发明所述镍-低密度脂蛋白鳌合 物的非变性电泳条带图，M泳道为非变性Marker，LDL泳道为低密度脂蛋白；
[0175] (4)检测：在胶床上找出含有镍的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶 解，然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有镍以及检测镍的含量。
[0176] D)鉴定结果
[0177] 1)AAS检测结果
[0178] 取步骤C)分离出的蛋白条带溶液，以石墨炉原子吸收光谱法（AAS)初步测定低密 度脂蛋白中重金属镍的含量，如下表所示，以NaCl溶液、KBr溶液、KC1溶液为空白对照。
[0179] 表1低密度脂蛋白中镍的含量
[0180]
[0181] 2)同步辐射X荧光分析
[0182] 蛋白条带内微量元素含量的SRXRF分析在北京正负电子对撞机（BEPC)的4W1〃 同步辐射束线上完成。储存环中电子束流能量为2. 2GeV，束流强度100mA。样品移动台 (TSA200型，北京卓立汉光公司）可在计算机控制的步进马达驱动下沿X、Y二维方向上移 动以改变入射光斑位置，移动步长为〇. 〇〇25_。从样品发射出的X射线由Si (Li)探测器 (PGT Inc.LS30143-DS)探测，探头与入射SR线共平面且相互垂直，距样品照射点20mm，信 号用PGT多道分析仪（MCA 4000)获取输出。用11. 5keV的单色同步辐射光激发样品，调节 入射光斑（lmmx 3mm)位置使之处于条带一端，在300s的测定时间内，光斑一直沿条带均勾 缓慢移动，计数结束时光斑移到该条带另一端。沿电泳方向每1mm取一个谱。采用AX IL 软件处理数据，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它元素峰进行归一处理，以抵 消束流强度变化对信号强弱产生的影响。在相同的条件下以同样的方式测量定量标准干胶 膜的荧光谱。
[0183] 图2为本发明所述的镍-低密度脂蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分 析图，图中横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该条带镍金属能量（含量）值。
[0184] 检测条件的确宙
[0185] 1.抗低密度脂蛋白抗体、抗Ni抗体最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍数的确 定。酶联免疫法检测镍_低密度脂蛋白螯合物的方法，具体包括以下步骤：
[0186] 1)包被：将抗低密度脂蛋白抗体蛋白包被于固相载体上，分别用稀释缓冲液将包 被蛋白以1 :250、1 :500、1 :10000、和1 :2000的倍比稀释，加入ELISA板微孔中，每个浓度包 被三排，4°C保存18小时；
[0187] 2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加入封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，洗 涤；
[0188] 3)加待测样本：用稀释缓冲液将待测血浆样本按1 :10、1 :20、1 :40的倍比稀释， 加入微孔中，以已知含量的镍-低密度脂蛋白螯合物作标准品，设置阴性对照和空白对照， 加入微孔中，37°C作用1小时；
[0189] 4)加二抗：移去待测血浆样本，洗涤，加入用稀释缓冲液按1:5000、1 :10000、1 : 200000U :40000的倍比稀释的抗Ni抗体，37°C作用1小时，使其与低密度脂蛋白上的金属 镍反应；
[0190] 5)加酶标：移去抗Ni抗体，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释的HRP酶标抗体，37°C作 用1小时，使其与抗Ni抗体反应；
[0191] 6)底物温育：移去酶标抗体，洗涤，加入底物，37°C避光作用30min，加入终止液；
[0192] 7)检测：于450nm波长下在酶标仪上分别读取标准品、待测血浆、阳性对照、阴性 对照和空白对照样本的0D值。
[0193] 本实施例中，采用本发明提供的镍-低密度脂蛋白螯合物标准品作为阳性对照， 分别以不加待测血浆作为阴性对照1，即依次加入了抗低密度脂蛋白抗体、封闭液、抗Ni抗 体、酶标和底物；
[0194] 以不加抗Ni抗体的对照试验组作为阴性对照2,即依次加入了抗低密度脂蛋白抗 体、封闭液、待测血浆、酶标和底物；
[0195] 以不加酶标的对照试验组作为阴性对照3、即依次加入了抗低密度脂蛋白抗体、封 闭液、待测血浆、抗Ni抗体和底物；
[0196] 以同时不加待测样本和抗Ni抗体的对照试验组作为阴性对照4,即依次加入了抗 低密度脂蛋白抗体、封闭液、酶标和底物；
[0197] 以不加抗低密度脂蛋白抗体作的对照试验组为空白对照1，即加入了封闭液、待测 血浆、抗Ni抗体、酶标和底物；
[0198] 以及以只加底物的对照试验组为空白对照2,以只加PBS的对照试验组为空白对 照3。
[0199] 表2为不同抗低密度脂蛋白抗体稀释倍比、血浆稀释倍比、抗Ni抗体稀释倍比的 样本0D值数据，
[0200] 表2不同抗低密度脂蛋白抗体、Ni抗体以及血浆稀释倍比下的检测结果
[0201]
[0202] 从表2可知，抗低密度脂蛋白抗体的稀释倍比为1:500时，样本0D值大于平行条 件下的其它抗低密度脂蛋白抗体的稀释倍比；该组样本中，血浆稀释倍比为1:10时，抗Ni 抗体稀释倍比为1:5000时，0D值最大，为0. 818。
[0203] 表3为抗低密度脂蛋白抗体的稀释倍比为1:500、血楽;稀释倍比为1:10、抗Ni抗 体稀释倍比为1:5000时相对应的阳性对照、阴性对照和空白对照的0D检测值，
[0204] 表3阳性对照、阴性对照及空白对照的检测结果
[0205]
[0206] 从表3可知，阴性对照组0D检测值小于0. 1，说明该优化条件下，本方法的系统误 差性小，满足分析方法要求，所以选此值所对应的浓度作为最佳工作浓度。
[0207] 2. ELISA洗脱液最佳工作浓度及洗脱时间确定
[0208] 为寻求最适宜的洗脱条件，通过酶联免疫法在抗Ni抗体与酶标抗体温育后，以不 同浓度的洗脱液进行洗脱，再通过酶标仪检测0D值，具体步骤如下：
[0209] (1)包被：将抗Ni抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液按1 :500的倍比稀释，加 入ELISA板微孔中，4°C保存16小时；
[0210] ⑵封闭：移去稀释缓冲液，洗涤后，加封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并洗 涤；
[0211] (3)加酶标抗体：移去封闭液，洗涤后，释至抗体浓度为2 y g/mL的HRP酶标抗体， 37°C