1. 42gNa2HP04、0. 96g柠檬酸，然后加入ddH20至50mL，即得；
[0050] 洗脱液的配制方法示例：将木瓜蛋白酶用pH 8. 0, 0. lmol/L Tris-HCI缓冲液配 制成l-2mg/mL，再加入lmmol/L二硫苏糖醇（DTT)37°C孵育30min，得洗脱液；
[0051] 上样缓冲液可由如下比例的组分配制而成：Tris-HCl :1%溴酚蓝：ddH20 :甘氨酸 =15. 5 : 2. 5 :7 :25,其中 Tris-HCI 的 pH 为 6. 8、摩尔浓度为 1M ;
[0052] 电泳缓冲液的配制方法如下：取3. 0g Tris、14. 4g甘氨酸、溶于800mLddH20中，调 pH至8. 3后，定容至1L ;
[0053] 捕获镍的物质为货号为"广州然科公司RK14419"的鼠抗Ni mAb，以下实施方式中 所述的与镍特异性结合的物质、抗Ni抗体、二抗、抗镍抗体均为捕获得镍的物质；
[0054] 本发明提供一种镍-低密度脂蛋白螯合物，镍离子与低密度脂蛋白通过巯基或/ 和半胱氨酸残基螯合而成。
[0055] 具体地，镍-低密度脂蛋白螯合物是由镍通过结合锌指结构、巯基、半胱氨酸残基 中的至少一种结构与低密度脂蛋白上的载脂蛋白B或胆固醇、甘油三酯等结合而形成的螯 合物。
[0056] 本发明还提供镍-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：
[0057] A)镍-低密度脂蛋白的合成：在提纯源于人体的低密度脂蛋白或按照生物学方法 重组的低密度脂蛋白中加入镍离子进行螯合反应，得到反应溶液；
[0058] B)镍-低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中 未反应的低密度脂蛋白、特异性抗体和镍离子，即得镍-低密度脂蛋白螯合物，具体包括以 下步骤：
[0059] (1)溶解样品：将上述步骤A)的镍-低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中，得 镍-低密度脂蛋白螯合物溶液；
[0060] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与低密 度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0061] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使低密 度脂蛋白与填料特异性结合；
[0062] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. 10m〇l/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0063] (5)收集：收集步骤⑷的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0064] (6)透析：将步骤（5)的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次后，4°C透 析过夜，收集样本；
[0065] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与镍特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0066] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0067] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0068] (10)收集：收集步骤（9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0069] (11)透析：将步骤（10)的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次后，4°C 透析过夜，收集样本，即得镍-低密度脂蛋白螯合物。
[0070] C):对镍-低密度脂蛋白螯合物的鉴定，具体包括以下步骤：
[0071] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0072] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的镍_低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲 液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0073] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0074] (4)检测：在胶床上找出含有镍的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶 解，然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有镍以及检测镍的含量。
[0075] 本发明还提供一种至少包括如上述的镍-低密度脂蛋白螯合物作为标准品的试 剂盒。
[0076] 在本发明中，能实现本发明目的的试剂盒可以列出以下几种，但并不限于此。
[0077] -种检测血样中镍-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可用于捕获低密 度脂蛋白的蛋白的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、可捕获镍的物质作为二抗、酶标抗体、底 物、终止液、稀释缓冲液、阳性对照、阴性对照等。
[0078] -种检测血样中镍-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可用于捕获低密 度脂蛋白的蛋白的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、洗脱液、阳性对照、阴性对照等。
[0079] -种检测血样中镍-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可用于捕获低密 度脂蛋白的蛋白的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、洗脱液、酸化剂、过氧化氢、标准品、阴性对 照等。
[0080] -种检测血样中镍-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋 白所需提取试剂、复溶液、含有可用于捕获镍的物质的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、酶标抗 体、底物、终止液、稀释缓冲液、标准品、阴性对照等。
[0081] -种检测血样中镍-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋 白所需提取试剂、复溶液、阳性对照、阴性对照等。
[0082] -种检测血样中镍-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋 白所需提取试剂、复溶液、酸化剂、过氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
[0083] -种检测血样中镍-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋 白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含有镍的蛋白条带所需液体、 含有可用于捕获镍的物质的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、酶标抗体、底物、终止液、阳性对 照、阴性对照等。
[0084] -种检测血样中镍-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋 白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含有镍的蛋白条带所需液体、 阳性对照、阴性对照等。
[0085] -种检测血样中镍-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中低密度脂蛋 白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含有镍的蛋白条带所需液体、 硝酸、过氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
[0086] 上述几种试剂盒中，所述阳性对照为标准品，即螯合有重金属镍的低密度脂蛋白 螯合物或螯合有重金属镍的BSA螯合物；所述阴性对照为稀释缓冲液。
[0087] 上述试剂盒用于检测镍-低密度脂蛋白螯合物，以提高检测的准确性和重复性， 并使之在临床中得到推广。
[0088] 本发明还提供一种定量检测镍-低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述 的镍-低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、 酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯镍-低 密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯镍-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合 法、提纯镍-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原 子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。在本发明中，用检测镍-低密度脂蛋白螯合 物的方法可以列出的有以下几种，但并不限于以下几种。
[0089] 方法一：酶联免疫法(ELISA法）检测镍-低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤检 测：
[0090] 1)包被：用稀释缓冲液稀释可以捕获低密度脂蛋白的蛋白至250-2000倍，加入 ELISA板微孔中，4°C过夜16-18小时，或37°C水浴1-3小时，储存冰箱；
[0091] 2)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入封闭 液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤缓冲液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37°C 放置1小时；
[0092] 3)加待测样本，并且温育：从循环系统取样，作待测样本；以已知含量的镍-低密 度脂蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释待测样本和标准品均稀释至10-40倍，加入 微孔中，37°C作用1-2小时；
[0093] 4)加入可以捕获镍的物质，并且温育：移去待测样本，并用洗涤缓冲液进行洗涤， 待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释5000-40000倍的抗镍抗体，37°C作用1-2小时，使抗 镍抗体与低密度脂蛋白上的金属镍反应；
[0094] 5)酶结合物温育：移去抗镍抗体，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释的HRP酶标抗体， 37°C作用1-2小时，使其与HRP酶标抗体反应；
[0095] 6)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底 物，37°C避光作用30分钟；
[0096] 7)终止反应：滴加终止液至每一微孔；
[0097] 8)取波长450nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上分别读取待测样本组和 标准品的0D值，绘制标准曲线，通过与标准品组比较，求得待测样本的含量。
[0098] 本方法中，步骤8)也可不使用酶标仪，直接通过染色情况进行定性检测。
[0099] 该方法利用ELISA原理，低密度脂蛋白上的镍可以被抗镍的特异性抗体所捕获， 之后可以再被辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体所捕获（该抗体不识别包被蛋 白），捕获上的抗体在显色剂及终止液的作用下，可以在仪器下读出0D值，而不含有螯合金 属镍的低密度脂蛋白，则不会被抗镍的特异性抗体所捕获，也不会与辣根过氧化物酶、碱性 磷酸酶等酶标记的抗体所捕获，而所用试剂中也不含有金属镍（阴性对照组结果为阴性）， 因而当所读取的0D值结果显示为阳性时，即可证明检测出低密度脂蛋白上螯合的金属镍。
[0100] 方法二：酶联免疫与原子吸收光谱结合法(ELISA法+AAS法）检测镍-低密度脂 蛋白螯合物按照如下步骤检测：
[0101] 1)包被：将能够捕获低密度脂蛋白的蛋白，如抗低密度脂蛋白抗体（抗低密度脂 蛋白抗体）包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释抗低密度脂蛋白抗体至250-2000倍，加 入ELISA板微孔中，4°C过夜16-18小时，或37°C水浴1-3小时，储存冰箱；
[0102] 2)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤缓冲液进行洗涤