Tbc人工免疫原tbc-bsa及其制备和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种TBC人工免疫原TBC-BSA及其制备和用途，具体是一种用于新 兴持久性有机污染物一一三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯免疫检测的TBC人工免疫原 TBC-BSA及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 溴代阻燃剂（Brominated Flame Retardant，BFRs)，指能使聚合物不容易着火或 者着火后使其燃烧变慢的一种助剂，是目前世界上产量和用量最大的有机阻燃剂之一。随 着多种溴代阻燃剂逐渐在多数国家和地区被禁止生产使用，新的溴代阻燃剂产品被逐渐开 发生产出以填补市场空白，三（2,3-二溴丙基）异氰脲酸酯（1'1^8(2,3-(1;[131'01]1(^1'〇口71) isocyanurate, TBC)就是新溴代阻燃剂的一个代表。TBC是溴代阻燃剂中的一种，分子结构 中含有六个溴原子，也属于三嗪系列阻燃剂。作为阻燃剂的新品种，TBC具有优异的阻燃性 能、热稳定性、不易光解、低发烟性等优点，被广泛用于纤维增强塑料、农用聚氨酯薄膜、聚 烯烃、聚氯乙烯（PVC)、聚苯烯、ABS树脂不饱和聚脂、合成橡胶和合成纤维等制品中。在上 述材料或产品中，TBC阻燃剂的含量一般在5-10% w/w。我国从二十世纪八十年代中期开 始生产、使用TBC产品，生产厂家集中在东南沿海和长江流域。
[0003] TBC阻燃剂也有溴代阻燃剂的不足，并存在一定的环境问题：如裂解时会释放出 有毒气体溴化氢，溴化氢易吸收空气中的水分形成氢溴酸，具有很强的腐蚀性，存在二次危 害。生物富集性和大气自由基氧化半衰期结果显示TBC具有与持久性有机污染物相类似 的持久性、长距离传输性和可生物富集性等理化特性，并可通过血脑屏障富集于脑组织中。 虽然现阶段TBC的生产使用并未被施加任何限制，但它已被纳入加拿大环境威胁生态物质 (Lower Ecological Concern)筛选名录中，作为一种高优先级化学品识别。
[0004] 目前，关于TBC的研究主要集中在水体、沉积物、大气等环境领域和生物体的毒性 方面，但样品的检测方法方面研究较少。目前对三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的检测手 段主要为气相色谱和高效液相色谱等仪器检测方法，这些方法虽然准确可靠，但对样品的 预处理方法和操作人员的专业性有很高的要求。正因为这些方法的处理复杂、耗时、仪器价 格昂贵而不适合推广使用，也不利于在环境污染事故现场快速检测。为克服这些缺点，寻求 一种快速、简便、灵敏且经济实用的分析方法就成为环境监测领域的主要研究方向。因此， 开展研究并建立有效、可靠的含溴阻燃剂的检测方法及标准，并通过相关的法规予以保障， 成为一项极为重要和迫切的工作。
[0005] 20世纪60年代发展起来的免疫分析是基于抗原和抗体的特异性、可逆性结合反 应的分析技术。免疫分析具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和高灵敏性，非常适合 复杂介质中痕量组分的分析。因此免疫分析具有的特异性强、灵敏度高、方法快捷简单、分 析通量大、检测成本低等优点，使得该类方法可以满足简单、快速、灵敏地检测持久性有机 污染物的要求。1985年美国Cetus公司的K. B. Mullis和R. K. Saiki等发明了一种特异性 DNA体外扩增技术，成为Polymerase Chain Reaction，简称PCR，即聚合酶链式反应。1992 年Sano等将免疫分析技术与PCR技术结合，发展出荧光免疫PCR技术。荧光免疫PCR技术 兼具了免疫分析的特异性强和PCR技术的灵敏度高（检测限高达10 11~10 12g/L)的特点， 可用于检测环境中痕量污染物。
[0006] 目前，尚无用荧光免疫PCR技术检测TBC的相关报道。而制备合格的TBC人工免 疫原是生物免疫得到高特异性抗TBC抗体的前提，更是建立TBC免疫检测分析方法的关键， 这将具有重要的应用价值和理论研究意义。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种步骤简单，速度快，产率高的三 (2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯人工免疫原（TBC-BSA)制备方法，为免疫得到特异性抗体和利 用人工抗原、抗体建立免疫检测方法奠定基础。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明提供了一种三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA，结构式 如式（I)所示：
[0010]
式（I ) ;BSA为牛血清蛋白。
[0011] 本发明还提供了一种三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA的制 备方法，包括以下步骤：
[0012] 采用戊二醛法将TBC半抗J
与蛋白质分子BSA偶联制备 人工免疫原TBC-BSA。
[0013] 优选地，所述TBC半抗原的制备方法包括如下步骤：
[0014] A1、将2, 4, 6-三（烯丙氧基）-1，3, 5-三嗪、水、氯化铜溶于甲苯后形成反应液a， 加热回流反应至原料点消失为止，得式（II )化合物；
[0015] A2、将所得式（II )化合杉
溶于二氯甲烷中形成反应液b，向反 应液b中加入液溴，保持回流反应，至反应完全，即得TBC半抗原。TBC半抗原化学名称为二 (2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯，分子式为C9H1QBr4N30 3,分子量527. 78。
[0016] 优选地，所述A1中，2, 4, 6-三（烯丙氧基）-1，3, 5-三嗪、水、氯化铜的摩尔比为 1:1:45~50,反应液a的温度为95~100°C ;所述A2中，式（II )化合物与液溴的摩尔比 为1:2~2. 5。理想状态下，2, 4, 6-三（烯丙氧基）-1，3, 5-三嗪、水、二水合氯化铜的摩尔 比为1:1:40,但为了反应顺利向右进行，二水合氯化铜需要过量但又不能超过理想用量的 15%回流搅拌加热的情况下，2, 4, 6-三（烯丙氧基）-1，3, 5-三嗪在95°C处于沸腾状态，那 么100°C更处于沸腾状态，反应向右进行。
[0017] 优选地，所述氯化铜为二水合氯化铜。
[0018] 优选地，所述步骤A2还包括反应完全后，向反应液b中加入饱和Na2S2(V^液至红 色消失，萃取反应液，分离，除杂质，干燥，重结晶TBC半抗原的步骤。
[0019] 优选地，所述采用戊二醛法将TBC半抗原与蛋白质分子BSA偶联制备人工免疫原 TBC-BSA具体包括以下步骤：
[0020] B、将TBC半抗原溶于非质子溶剂中，形成TBC半抗原溶液；牛血清蛋白BSA溶于 PBS中，形成牛血清蛋白溶液；将所述TBC半抗原溶液滴入牛血清蛋白溶液中形成反应液 c；
[0021] C、向反应液c中加入戊二醛，搅拌反应；
[0022] D、反应结束后，离心分离上清液，将上清液装入透析袋中透析，离心分离沉淀后得 即得三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯人工免疫原TBC-BSA。
[0023] 本发明采用戊二醛法合成三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯人工免疫原，其反应方 程式如下：
[0024]
[0025] 上述反应方程式中，中间产救
一端的醛基与牛血清蛋白BSA -端 的氨基结合，偶联脱水，生成了 TBC人工全抗原
[0026] 优选地，所述TBC半抗原、戊二醛、BSA的摩尔比为1:30~50:0. 005~0. 05。
[0027] 优选地，步骤C中，所述搅拌时间为18~24小时。
[0028] 为充分反应，根据经验，当半抗原与戊二醛、BSA反应的摩尔比是1:50:0. 005时搅 拌反应18小时就可以，当半抗原与戊二醛、BSA反应的摩尔比是1:30:0.05时反应就需要 24小时。
[0029] 优选地，步骤B中，所述非质子溶剂为N，N_二甲基甲酰胺或二甲亚砜；所述将TBC 半抗原溶液滴入BSA溶液是在0~4°C低温磁力搅拌下进行。所有需要保持蛋白活性的长 时间反应都需要在低温情况下进行，经验表明0~4°C最合适。
[0030] 本发明还提供了一种三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA的用 途，其特征在于，用于痕量溴代阻燃剂三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的检测。
[0031] 人工免疫原的表征：
[0032] 将制备的人工免疫原适当稀释，使其吸光度在0. 1~2之间，以PBS为空白对照， 用紫外分光光度计在200~500nm分别测定TBC半抗原和TBC-BSA吸光值，绘制紫外吸收 光谱图，并根据以下公式计算偶联比：
[0033]
[0034]式中：〇DCC]_gate 偶联物吸光度；〇Dprotein 蛋白质吸光值；〇Dhapten 半 抗原吸光值；Chapten--半抗原浓度；Cprotein--蛋白质浓度；M hapten--半抗原分子量； Mpr〇tein--蛋白质分子量。
[0035] 本发明的三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯人工免疫原TBC-BSA的应用，通过免疫 动物制备抗三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯特异性抗体，能与三（2, 3-二溴丙基）异氰脲 酸酯发生特异性免疫反应的免疫球蛋白IgG反应，