C半抗原和载体蛋白的吸收特征。免疫原包含了半抗原和载体蛋白的特征吸收峰，且半 抗原特征吸收峰发生了蓝移，这可能是受到载体蛋白在270nm左右吸收峰的影响所致。吸 收峰蓝移现象的出现，说明TBC半抗原偶联到载体蛋白表面，人工免疫原制备成功。计算 TBC-BSA中TBC与BSA的结合比为36:1。
[0070] 实施例6三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸醅免痔原蛋白质浓度的测宙
[0071] 根据考马斯亮蓝G250法测定免疫原蛋白质浓度。考马斯亮蓝G250在游离时为红 色，与蛋白质结合后为青蓝色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm处。以BSA为标准物 质配置不同浓度标准溶液，与一定量考马斯亮蓝G250反应后，分别在595nm处测定溶液吸 光度值。标准溶液在0-150 y g/mL范围内线性关系良好。在稀释一定倍数的免疫原溶液中 加入考马斯亮蓝染色，在相同波长处测量吸光度值，后与标准曲线比较，得制备的免疫原蛋 白质浓度为5. 34mg/mL。这些免疫原既可以用于免疫动物，通过动物产生的免疫反应得到可 以用来做免疫分析的单克隆或多克隆抗体，又可以作为免疫竞争对象而使用。
[0072] 实施例7动物免痔实验验证
[0073] 选择2只成年健康雄性新西兰白兔，合成出的人工免疫原经过与弗氏完全佐剂充 分混合后，对大白兔进行颈部和背部点状注射免疫，经过7次加强免疫后，采用间接酶联免 疫分析法测定抗血清效价，其抗血清效价均已达到100000,具体效价变化见图4。试验显示 交叉反应均不明显，说明其特异性较好。
[0074] 实施例8直接竞争免痔PCR方法检测三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸醅
[0075] 为了增强PCR管的吸附性，用0. 8 %的戊二醛对PCR管进行预处理，每孔加入 20 y L戊二醛溶液，37°C下温育5小时，然后用超纯水洗涤3次，甩干备用；用包被缓冲液 (0.0511口119.6()碳酸盐缓冲液）将人工包被原〇^(：-0￥4)稀释至适当浓度，加入到经过戊 二醛处理的PCR管中进行包被，每孔20 y L，4°C下包被过夜；倒掉包被原，每孔加入200 y L 洗涤液（0.01M pH 7.40PBST)进行洗涤，振荡3分钟后甩干，洗三遍后加入200 yL封闭液 (含3%卵清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液），37°C下温育1小时；洗板三次，将生物素化抗TBC 多克隆抗体稀释至适当浓度，每孔加入10 y L生物素化抗体及10 y L TBC小分子，空白对 照孔中加入20 y L PBS，37°C下温育30分钟；洗板三次并甩干，用0. 01M pH 7. 40PBS将亲 和素稀释至适当倍数，每孔加入20 yL，37°C下温育30分钟；洗板三次并甩干，用0. 01M pH 7. 40PBS将生物素化DNA稀释至适当倍数，每孔加入20 y L，37°C下温育30分钟；倒掉溶液 后用洗脱液重复洗涤五次，再用超纯水重复洗涤五次；最后加入扩增引物和荧光物质，采用 20 yL的扩增体系，每孔加入10 yL PCR试剂盒mixture，上下游引物各加入0. 25 yL，超纯 水9. 5 y L ;在加入PCR扩增试剂时，在荧光PCR反应仪中进行扩增（PCR扩增程序：94°C预 变性 4min ;94°C 20s，55°C 20s，72°C 20s，以此进行 30 个循环；72°C延伸 3min)。测定的 Ct 值与待测抗原的量成反比。根据加入已知浓度的抗原和相应的Ct值作标准曲线，从而可以 得到相应待测样品中三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的浓度。其测定的扩增曲线与建立的 标准曲线如图5和图6所示。
[0076] 实验所用到的生物素化DNA (双链DNA详情如下：5'-Bio-GAAITCGAGCTCGGTACCCGG GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3 ' 和 5 '-Bio-AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGA GGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAAITC-3'）以及相对应的上游引物（5' -GTAAAACGACGGCCAGT-3'） 和下游引物（5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3'）均由生工生物工程（上海）股份有限公司制备 合成。
[0077] 所述人工包被原TBC-0VA的制备方法如下：0. lmmol TBC半抗原溶于lmL N，N-二 甲基甲酰胺中，120mg 0VA溶于10mL PBS中；0°C低温磁力搅拌下，逐滴将TBC半抗原溶液滴 入0VA溶液中，滴加结束后向反应体系中加入120 yL 25%戊二醛，使TBC半抗原、戊二醛、 0VA的摩尔比为1:30:0. 005,继续低温搅拌18小时；反应结束后，低温离心分离上清液，将 上清液装入透析袋中，用PBS透析3天，每天换水3次，离心分离沉淀后得三（2, 3-二溴丙 基）异氰脲酸酯人工包被原TBC-0VA。经紫外-可见分光光度计鉴定后，小量分装，-20°C 冷冻保存。
[0078] 当TBC浓度在0. lpg/L-100pg/L时线性相关性较好，线性方程为Ct = 1. 0711gC+14. 3(R2= 0. 974, n = 5)，检测限为0. 97pg/L。与传统仪器分析方法相比，灵敏 度提高了 1000-5000倍。
[0079] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA，其特征在于，结构式如 式⑴所示：2. -种如权利要求1所述的三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA的 制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：免疫原TBC-BSA。3. 如权利要求2所述的三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA的制备 方法，其特征在于，所述TBC半抗原的制备方法包括如下步骤： AU将2, 4, 6-三（烯丙氧基）-1，3, 5-三嗪、水、氯化铜溶于甲苯后形成反应液a，加热A2、将所得式（II)化合物溶于二氯甲烷中形成反应液b，向反应液b中加入液溴，保持 回流反应，至反应完全，即得TBC半抗原。4. 如权利要求3所述的三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA的制备 方法，其特征在于，所述步骤Al中，2, 4, 6-三（烯丙氧基）-1，3, 5-三嗪、水、氯化铜的摩尔 比为1:1:45~50,反应液a的温度为95~100°C;所述步骤A2中，式（II)化合物与液溴 的摩尔比为1:2~2. 5。5. 如权利要求3所述的三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA的制备 方法，其特征在于，所述步骤A2还包括反应完全后，向反应液b中加入饱和Na2S2O3溶液至 红色消失，萃取反应液，分离，除杂质，干燥，重结晶TBC半抗原的步骤。6. 如权利要求2所述的三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA的制备 方法，其特征在于，所述采用戊二醛法将TBC半抗原与蛋白质分子BSA偶联制备人工免疫原 TBC-BSA具体包括以下步骤： B、 将TBC半抗原溶于非质子有机溶剂中，形成TBC半抗原溶液；牛血清蛋白BSA溶于 PBS中，形成牛血清蛋白溶液；将所述TBC半抗原溶液滴入牛血清蛋白溶液中形成反应液 c； C、 向反应液c中加入戊二醛，搅拌反应； D、 反应结束后，离心分离，将上清液装入透析袋中透析，离心分离沉淀后得即得三 (2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯人工免疫原TBC-BSA。7. 如权利要求6所述的三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA的 制备方法，其特征在于，所述TBC半抗原、戊二醛、牛血清蛋白BSA的摩尔比为1:30~ 50:0. 005 ~0. 05。8. 如权利要求6所述的三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA的制备 方法，其特征在于，步骤C中，所述搅拌时间为18~24小时。9. 如权利要求6所述的三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA的制 备方法，其特征在于，步骤B中，所述非质子溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜，所述将 TBC半抗原溶液滴入BSA溶液是在0~4°C低温磁力搅拌下进行。10. -种如权利要求1所述的三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的人工免疫原TBC-BSA的用途，其特征在于，用于痕量溴代阻燃剂三（2, 3-二溴丙基）异氰脲酸酯的检测。
【专利摘要】本发明提供了一种TBC人工免疫原TBC-BSA及其制备方法和用途，所述TBC-BSA的结构式为：其制备方法为通过将TBC半抗原与蛋白质分子BSA偶联制备获得。本发明免疫原制备方法简单，稳定性好，成本低，易于工业化生产。三(2,3-二溴丙基)异氰脲酸酯人工免疫原TBC-BSA通过免疫动物后制备成特异性抗体，为建立免疫检测方法奠定基础。
【IPC分类】C07K14/765, C12Q1/68
【公开号】CN105037525
【申请号】CN201510483198
【发明人】庄惠生, 孙瑞艳, 卜聃
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月7日