干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明一般的涉及干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法，两者的 药物组合物和在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途；特别的涉及干扰素A的去半胱氨 酸突变体及其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法，两者的药物组合物和在制备治疗病毒性 疾病的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 干扰素（interferon, IFN)是一种最初由动物机体产生的兼具抗病毒、抗增殖与 免疫调节作用的细胞因子蛋白质类药物，根据其产生部位、作用机理、药效特点等的不同可 以分为I、II、III三种大的类型。其中I型干扰素主要是指干扰素a与干扰素0，干扰素 a又有包括干扰素a 2a、干扰素a 2b、干扰素a lb在内的超过20种的天然亚型；II型干 扰素主要是指干扰素y ;iii型干扰素主要是指干扰素a，包括干扰素a1、干扰素a2、干 扰素A 3三种天然亚型。
[0003] 相较于1、11型干扰素，III型干扰素的发现与报道较晚。其中干扰素A 1最早由 津莫吉尼蒂克斯公司公开于其国际专利申请PCT/US2001/021087(国际公布日2002年1月 10日）中。其由181个氨基酸构成，并在自N端计的第15位、第49位、第112位、第145 位、第171位有5个半胱氨酸。这5个半胱氨酸形成两对分子内二硫键。
[0004] 干扰素X2与干扰素A3随后亦由津莫吉尼蒂克斯公司公开于其国际专利申请 PCT/US2002/012887(国际公布日2002年10月31日）中。它们均由175个氨基酸构成，并 在自N端计的第16位、第48位、第50位、第115位、第148位、第167位、第174位有7个 半胱氨酸。这7个半胱氨酸形成三对分子内二硫键。
[0005] 对比研究结果表明，在三种干扰素A分子中，干扰素A 3的抗病毒活性最高，干扰 素A2的抗病毒活性最低，而干扰素A 1的抗病毒活性居中。
[0006] 干扰素X 1在最初公开时的代号为zcyto21，干扰素A 2在最初公开时的代号为 2〇又1:〇20，干扰素13在最初公开时的代号为2〇71:〇22。在随后的研究中由于发现它们的基 因、蛋白质三级结构与白介素10 (IL-10)非常接近，因此它们被归于白介素10家族，分别被 重新命名为 IL-29、IL-28A 与 IL-28B。
[0007] 尽管zcyt〇21、zcyt〇20与干扰素a的氨基酸序列一致性（也即同源性）只有 17%，与干扰素0的氨基酸序列一致性只有14%，与干扰素Y的氨基酸序列一致性只有 4% ;ZCyt〇22与干扰素a的氨基酸序列一致性只有16%，与干扰素0的氨基酸序列一致 性只有13%，与干扰素丫的氨基酸序列一致性只有4%，但它们在随后的研究中都发现和 确认与传统的干扰素有相似的信号转导途径，有很多类干扰素性质。因此从功能的角度出 发，它们最终分别被命名为干扰素M、干扰素A 2与干扰素入3。
[0008] 作为最早发现与最重要研究开发干扰素X的公司，津莫吉尼蒂克斯公司在发现 三种天然的干扰素A分子并研究其作用机理与药理活性后，又研究了干扰素A的突变 体、干扰素A或其突变体的聚乙二醇衍生物、干扰素A或其突变体或其衍生物的制备 方法、干扰素A或其突变体或其衍生物的医药用途、干扰素A或其突变体或其衍生物 的联合用药等，并在此基础上形成了一系列的各国专利申请与授权专利。例如国际专利 申请PCT/US2004/025864(国际公布日2005年3月17日）公开了诸多的干扰素A的 突变体及其聚乙二醇衍生物；国际专利申请PCT/US2005/026951(国际公布日2006年2 月2日）公开了 IL-28和IL-29治疗癌症和自身免疫性疾病的方法；国际专利申请PCT/ US2006/039139(国际公布日2007年4月12日）公开了生产IL-29的方法；国际专利申请 PCT/US2009/046451 (国际公布日 2009 年 12 月 10 日）公开了 IL-28A、IL-28B 和 IL-29 治 疗丙型肝炎的方法。
[0009] 虽然现有技术中与干扰素A相关的绝大多数研究和/或开发工作由津莫吉尼蒂 克斯公司从事与完成，并在此基础上形成了众多的专利与非专利公开文献，但国内外亦有 一些其它公司/研究机构在从事干扰素X的研究和/或开发工作，并报道了研究和/或开 发成果。例如申请人帝国创新有限公司在其国际专利申请PCT/GB2006/050281 (国际公布 日2007年3月15日）中公开了干扰素A治疗呼吸道疾病的方法；申请人汕头大学医学院 在其中国专利申请200410052377. 8 (公布日2005年9月21日）中公开了 IL-29的生产方 法及重组IL-29工程菌；申请人武汉大学在其中国专利申请200910062246. 0 (公布日2009 年11月11日）中公开了干扰素A在抗人类免疫缺陷病毒中的应用；申请人北京凯因科技 股份有限公司在中国专利申请201110020949. 4 (公布日2012年7月18日）中公开了 PEG 化的干扰素A，其是由巯基聚乙二醇修饰剂修饰干扰素A得到。
[0010] -系列的研究结果表明，与传统的1、11型干扰素相比，干扰素X有独特的细胞靶 向性与受体分布的组织特异性，而且很多临床不良反应如骨髓抑制、ALT/AST升高、发热、恶 寒、恶心、关节痛等明显降低，因此干扰素X在治疗上呼吸道感染疾病中有明显的优势。但 是由于干扰素A本身的体内外活性低于传统的1、11型干扰素，加之干扰素A作为细胞因 子蛋白质类药物存在稳定性差、半衰期短的特点，这些缺点都限制了其临床推广应用的前 景。因此，有必要在已有干扰素A及其突变体的基础上研究新的干扰素A突变体，以进一 步改善干扰素A的稳定性，并提高其生物学活性（抗病毒活性）。在此基础上，有必要优选 与优化蛋白质的长效技术用于干扰素A的突变体，以在尽可能高的保留干扰素A的生物 学活性的基础上进一步改善其稳定性，并延长其体内药代半衰期。
【发明内容】
[0011] 本发明的首要目的是提供一种干扰素X的去半胱氨酸突变体，以解决现有的干 扰素A1氨基酸序列中有奇数个半胱氨酸，造成其性质不稳定，抗病毒活性偏低的缺点。
[0012] 为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明的干扰素X的去半胱氨酸突变体将 干扰素A 1氨基酸序列中从N端计的第112位的半胱氨酸（Cys，C)突变为色氨酸（Ser，S)， 具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0013] 为了获得干扰素A的去半胱氨酸突变体，需要先后进行表达干扰素A去半胱氨 酸突变体分子的基因工程菌或基因工程细胞的构建、基因工程菌或基因工程细胞的发酵和 发酵产物的纯化，优选进行表达干扰素A去半胱氨酸突变体分子的大肠杆菌工程菌的构 建、发酵和发酵产物的纯化。
[0014] 在基因工程菌或基因工程细胞的构建过程中，首先需要获得并扩增表达干扰素入 去半胱氨酸突变体的基因，采用的方法包括但不局限于全基因合成、PCR法（包括重叠延伸 PCR法）。在大量获得表达干扰素A去半胱氨酸突变体的基因后选择适宜的载体，用本领域 技术人员公知的构建重组载体的方法将表达干扰素A去半胱氨酸突变体的基因转入所述 载体从而构建重组载体。所述重组载体优选质粒载体，一般含有启动子、多克隆位点（MCS) 和终止子，并应具有一组或多组双酶的各自单一的酶切位点，适宜被转入对应的宿主菌或 宿主细胞。当选择的宿主菌或宿主细胞为真核宿主菌或真核宿主细胞时，还需进一步选择 分泌表达或胞内可溶性表达的载体。例如当用毕赤酵母作为表达系统时前者包括但不局 限于 pHIL-Sl、pPIC9、pPIC9K、pPICZ a、pGAPZ a、pYAM75P，后者包括但不局限于 pHIL-D2、 pA0815、pPIC3K、pPIC3. 5K、pPICZ、pHWOlO、pGAPZ。
[0015] 然后利用电穿孔法、PEG法、氯化锂法、原生质体转化法等本领域技术人员公知 的方法将重组载体转入宿主菌或宿主细胞构建表达干扰素A去半胱氨酸突变体的基因 工程菌或基因工程细胞。所述的宿主菌或宿主细胞可以选择原核宿主菌，例如大肠杆菌 (Escherichia coli)、乳酸杆菌（Lacticacid bacteria)等，优选大肠杆菌；也可以选择真 核宿主菌或宿主细胞，例如毕赤酵母（Pichia. pastoris)、汉逊酵母（Hansenula anomala)、 CH0细胞等，优选毕赤酵母。
[0016] 工程菌或工程细胞的发酵应选择适宜其生长的培养基组成、pH、温度、通气量、培 养时间与补料操作等条件。
[0017] 对于大肠杆菌工程菌的发酵条件：优选LB培养基，培养过程中的温度控制在 30-37°C之间；pH控制在6. 0-8. 0之间（必要时选择pH调节剂控制pH，所述的pH调节剂包 括但不限于NaOH、氨水及各种有机氮源，优选氨水）；通气量（溶氧）应满足菌体或细胞的 生长需要及产物表达合成的需要；培养时间与补料操作的方式相关，在采取适宜的补料操 作条件的情况下培养时间为6-48小时之间。
[0018] 而对于真核表达系统工程菌的发酵条件，尤其是毕赤酵母工程菌的发酵条件：常 用的诱导表达前培养基包括但不局限于LB培养基、YH)培养基、YPDS+Zeocin培养基、MGY培 养基、MGYH培养基、BMG培养基、BMGY培养基、BSM培养基、RD培养基、RDH培养基、MD培养 基、MDH培养基、S0C培养基、MM培养基；诱导表达后的培养基中需含有一定浓度的甲醇以全 部替代或部分替代诱导表达前培养基中的碳源物质，由于甲醇浓度过低不利于产物的诱导 表达，而甲醇浓度过高时会对产物的诱导表达形成抑制，所以培养基中甲醇的浓度优选在 0. l-l〇g/L之间，并更优选在0. 5-5g/L之间；菌体生长过程中的温度一般应控制在28-30°C 之间，不可超过32°C，而诱导表达时的温度一般应低于菌体生长过程中的温度，在20-28°C 之间；培养过程中的pH应控制在3. 0-7. 0之间（必要时选择pH调节剂控制pH，所述的pH 调节剂包括但不限于NaOH、氨水及各种有机氮源，优选氨水），且菌体生长和诱导表达时适 宜的pH往往有所不同；通气量（溶氧）应满足菌体生长需要及产物表达合成的需要，一般 应控制在20-30%之间；培养时间与补料操作的方式相关，在采取适宜的补料操作条件的 情况下培养时间为12-180小时之间。
[0019] 干扰素A去半胱氨酸突变体蛋白如果表达在工程菌或工程细胞内，需要对发酵 培养收获的菌体或细胞进行破碎处理以释放出其中的干扰素X去半胱氨酸突变体蛋白。 而对于大肠杆菌等原核的工程菌，更需要破碎处理以释放出以包涵体形式表达的干扰素入 去半胱氨酸突变体蛋白。常用的破碎方法包括但不局限于超声波破碎、球磨机破碎、溶菌酶 处理等。
[0020] 对于以包涵体形式表达的干扰素X去半胱氨酸突变体蛋白，需要对破碎处理得 到的粗包涵体进行洗涤操作以尽可能除去其中含有的少量菌体蛋白、膜蛋白等杂蛋白。洗 涤过程中使用