提供;MTT、DMF、DMF溶剂、结晶紫均由Sigma公司提供。以下干扰素A或其突变体或其 聚乙二醇衍生物的体外抗病毒活性检测中相同。干扰素A 1的制备方法参照中国专利申请 201110020949. 4说明书实施例1-4公开的方法）。可见，本发明的干扰素A第112位点去 半胱氨酸突变体的体外抗病毒活性是未突变干扰素A 1的7. 36倍。
[0125] 实施例3 :干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体与干扰素A 1的25°C稳定性试 验结果
[0126] 表1干扰素X第112位点去半胱氨酸突变体25°C稳定性试验结果
[0127]
[0131] 实施例4 :干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体的聚乙二醇修饰、产物纯化与 初步检测
[0132] 1)分子量为20KDa的mPEG-PALD的修饰反应和修饰产物分离、检测
[0133] 将实施例2用CM S印harose FF色谱柱分离得到的干扰素A第112位点去半胱氨 酸突变体用10倍体积的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH5. 5缓冲液稀释后上用同样的醋酸-醋 酸钠缓冲液平衡的CM Sepharose FF色谱柱，用同样的醋酸-醋酸钠缓冲液冲洗色谱柱后 用含0? 5mol/L的NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH5. 5缓冲液洗脱，得到浓度达3. Omg/ ml的浓缩突变体溶液。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之 间。
[0134] 取上述浓缩后的突变体溶液5ml，在冰浴条件下添加硼氰化钠母液至其终浓度为 20mmol/L，然后按1:2的质量比加入30mg平均分子量为20KDa的北京键凯科技有限公司商 品化的mPEG-PALD，室温弱光反应14-18小时。
[0135] 反应时间到后用200ml 25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5溶液稀释反应液以终止反 应，然后上用同样缓冲液平衡的TSKgel CM650S填料柱，未修饰聚乙二醇修饰剂在上样过 程中流穿。在用含70mmol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5溶液洗脱修饰物杂质 后用含0. 18mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5溶液洗脱目的修饰物，最后用含 0. 5mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5溶液洗脱未被修饰的干扰素A去半胱氨 酸突变体。该分离过程中的上样、冲洗与洗脱线性流速应控制在40-150cm/h之间。
[0136] 用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测分离得到的聚 乙二醇衍生物的纯度，结果均在97%以上。用MALDI-T0F质谱法检测其分子量为39656. 52。 用前述
【发明内容】
部分所述的H印G2细胞/EMCV病毒系统的检测方法测定其体外抗病毒活性 ED50 为 0? 235ng/ml。
[0137] 2)分子量为20KDa的mPEG-SBA的修饰反应和修饰产物分离、检测
[0138] 将实施例2用CM S印harose FF色谱柱分离得到的干扰素A第112位点去半胱 氨酸突变体用10倍体积的25mmol/L Tris-HCl，pH8. 5缓冲液稀释后上用同样的Tris-HCl 缓冲液平衡的DEAE S印harose FF色谱柱，用同样的Tris-HCl缓冲液冲洗色谱柱后用含 0? 5mol/L 的 NaCl 的 25mmol/L Tris-HCl，pH8. 5, pH8. 5 缓冲液洗脱，得到浓度达 4. Omg/ml 的浓缩突变体溶液。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
[0139] 取上述浓缩后的突变体溶液5ml，按1:2的质量比加入40mg平均分子量为20KDa 的北京键凯科技有限公司商品化的mPEG-SBA修饰剂，室温在水平摇床上以20转/分的速 度震摇反应6小时。
[0140] 反应时间到后用100ml 25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5溶液稀释反应液以终止反 应，然后上用同样缓冲液平衡的TSKgel CM650S填料柱，未修饰聚乙二醇修饰剂在上样过 程中流穿。在用含75mmol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5溶液洗脱修饰物杂质 后用含0. 22mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5溶液洗脱目的修饰物，最后用含 0. 5mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5溶液洗脱未被修饰的干扰素A去半胱氨 酸突变体。该分离过程中的上样、冲洗与洗脱线性流速应控制在40-150cm/h之间。
[0141] 用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测分离得到的聚 乙二醇衍生物的纯度，结果均在97 %以上。用MALDI-T0F质谱法检测其分子量为39713. 44。 用前述
【发明内容】
部分所述的H印G2细胞/EMCV病毒系统的检测方法测定其体外抗病毒活性 ED50 为 0? 291ng/ml。
[0142] 实施例5 :干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体的聚乙二醇修饰产物的25°C稳 定性试验结果
[0143] 表3干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体mPEG-PALD修饰产物25°C稳定性试 验结果
[0144]
[0145] 表4干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体mPEG-SBA修饰产物25°C稳定性试 验结果
[0146]
[0147] 实施例6 :干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇修饰产物的药代 动力学试验
[0148] 取体重为180g至220g的Wistar大鼠32只，均分为4组，每组8只，雌雄各半。 组1至组4分别皮下单次注射干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体、干扰素A 1、干扰素 入第112位点去半胱氨酸突变体mPEG-PALD(分子量20KDa，单链）修饰产物、干扰素A第 112位点去半胱氨酸突变体mPEG-SBA (分子量20KDa，单链）修饰产物，分别于0,0. 2,0. 5， 0. 75,1，2,4,8,12, 24,48, 72,96,168小时眼底取血，离心收集血清后测定其中干扰素人或 其突变体或其聚乙二醇衍生物的体外抗病毒活性。由测定结果平均值计算得到如下表5所 示的主要药代动力学参数。
[0149] 表5用SD大鼠单次测定得到的主要药代动力学参数
[0150]
[0151] 实施例7 :干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇修饰产物的小鼠 急性毒性试验
[0152] 取体重为20g左右的小鼠48只，均分为4组，每组12只，雌雄各半。组1至组4分 别皮下单次注射干扰素X第112位点去半胱氨酸突变体、干扰素A 1、干扰素A第112位 点去半胱氨酸突变体mPEG-PALD(分子量20KDa，单链）修饰产物、干扰素A第112位点去 半胱氨酸突变体mPEG-SBA (分子量20KDa，单链）修饰产物。注射后连续观察14天，除组2 有1只小鼠活动略显减少，体重增长略显缓慢外，其他组未见任何异常表现，表明小鼠对干 扰素A第112位点去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇修饰产物的最大耐受量均在6. 4mg/Kg 以上，相当于人临床用量的3840倍。干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体及其聚乙二 醇修饰产物较干扰素A1的安全性明显提高。
【主权项】
1. 干扰素去半胱氨酸突变体，其特征是将干扰素氨基酸序列中从N端计的第112位的 半胱氨酸突变为色氨酸，具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的干扰素去半胱氨酸突变体的聚乙二醇衍生物，其特征是所述 的聚乙二醇衍生物由所述的干扰素去半胱氨酸突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的 聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa-40KDa之间。3. 根据权利要求2所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂的分子量 在 10KDa-20KDa 之间。4. 根据权利要求2所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂是普通氨 基聚乙二醇修饰剂。5. 根据权利要求4所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的普通氨基聚乙二醇修饰剂 选自羧基聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺碳酸酯聚乙二醇修饰剂、苯并三唑碳酸酯聚乙二醇 修饰剂、琥珀酰亚胺聚乙二醇修饰剂、琥珀酰羧甲基酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺丁酸酯 聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺己酸酯聚乙二醇修饰剂、硝基苯碳酸酯聚乙二醇修饰剂、琥珀 酰亚胺戊二酯聚乙二醇修饰剂、Y形NHS酯聚乙二醇修饰剂、Y形羧基聚乙二醇修饰剂中的 一种。6. 根据权利要求2所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂是N末端 氨基聚乙二醇修饰剂。7. 根据权利要求6所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的N末端氨基聚乙二醇修 饰剂选自丙醛聚乙二醇修饰剂、Y形丙醛聚乙二醇修饰剂、Y形乙醛聚乙二醇修饰剂中的一 种。8. 根据权利要求2-7之一所述的聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤： 1) 制备浓缩的所述的干扰素去半胱氨酸突变体溶液，使其浓度达到2. 0-20mg/ml，并 使所述的干扰素去半胱氨酸突变体所处的缓冲溶液体系转换为适宜进行聚乙二醇修饰反 应的缓冲溶液体系； 2) 将上述得到的浓缩的干扰素去半胱氨酸突变体溶液与聚乙二醇修饰剂接触进行修 饰反应； 3) 对修饰反应后得到的混合物进行色谱分离纯化，以除去其中未参与修饰反应的聚乙 二醇修饰剂和未参与修饰反应的所述的干扰素去半胱氨酸突变体，并除去连接有多个聚乙 二醇分子的干扰素去半胱氨酸突变体聚乙二醇衍生物。9. 根据权利要求1-7之一所述干扰素去半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生物的药物 组合物，其特征是含有治疗有效量的所述的干扰素去半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生 物，以及适宜量的可药用载体。10. 根据权利要求1-7之一所述的干扰素去半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生物在制 备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，涉及干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法，两者的药物组合物和在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。所述的干扰素突变体是将干扰素氨基酸序列中从N端计的第112位的半胱氨酸突变为色氨酸，具有SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列；所述的干扰素突变体的聚乙二醇衍生物是由所述的干扰素突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa–40KDa之间。本发明的干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物有更高的抗病毒活性，更好的药理作用与稳定性，并具有更可靠的安全性。
【IPC分类】C07K1/107, C07K14/555, A61P31/12, C07K1/16, A61K47/48, A61K38/21
【公开号】CN105037523
【申请号】CN201510357973
【发明人】刘金毅, 靳维维, 周敏毅, 徐晨, 程永庆
【申请人】北京三元基因工程有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月25日