gel CM-5PW、TSKgel DEAE-5PW等。在这一纯化过程中，由于聚乙二醇修饰剂不带电荷，所以在 上样过程中不会被吸附。
[0094] 由于聚乙二醇是一个既亲水又亲酯的分子，用于修饰蛋白质分子后会提高蛋白质 分子的亲酯性能，且分子量越大，连接的分子个数越多这种提高越明显，因此可以利用修饰 前后蛋白质分子这一疏水性能的改变对目标单位点聚乙二醇修饰的干扰素X去半胱氨酸 突变体分子与杂质进行疏水作用色谱（hydrophobic interaction chromatography, HIC) 分离，可以米用的填料包括但不限于Phenyl Sepharose 6 FF、Butyl Sepharose 4 FF、 Source 15PHE、Source 15ETH、TSKgel Ether-5PW、TSKgel Phenyl-5PW 等。
[0095] 纯化获得的干扰素A去半胱氨酸突变体氨基聚乙二醇修饰剂修饰衍生物也需要 进行纯度、分子量、体外抗病毒活性、稳定性、药代、安全性等评价，方法同前所述的未修饰 的干扰素A去半胱氨酸突变体。
[0096] 在一种优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇修饰剂的分子量在10KDa_20KDa之 间。
[0097] 在一种优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇修饰剂是普通氨基聚乙二醇修饰 剂。
[0098] 在一种更加优选的实施方案中，本发明的普通氨基聚乙二醇修饰剂选自羧基聚乙 二醇修饰剂、琥珀酰亚胺碳酸酯聚乙二醇修饰剂、苯并三唑碳酸酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰 亚胺聚乙二醇修饰剂、琥珀酰羧甲基酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺丁酸酯聚乙二醇修饰 剂、琥珀酰亚胺己酸酯聚乙二醇修饰剂、硝基苯碳酸酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺戊二酯 聚乙二醇修饰剂、Y形NHS酯聚乙二醇修饰剂、Y形羧基聚乙二醇修饰剂中的一种。
[0099] 在一种优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇修饰剂是N末端氨基聚乙二醇修饰 剂。
[0100] 在一种更加优选的实施方案中，本发明的N末端氨基聚乙二醇修饰剂选自丙醛聚 乙二醇修饰剂、Y形丙醛聚乙二醇修饰剂、Y形乙醛聚乙二醇修饰剂中的一种。
[0101] 本发明的第三个目的是提供上述干扰素X去半胱氨酸突变体聚乙二醇衍生物的 制备方法，包括如下步骤：
[0102] 1)制备浓缩的所述的干扰素X去半胱氨酸突变体溶液，使其浓度达到2. 0_20mg/ ml，并使所述的干扰素X去半胱氨酸突变体所处的缓冲溶液体系转换为适宜进行聚乙二 醇修饰反应的缓冲溶液体系；
[0103] 2)将上述得到的浓缩的干扰素A去半胱氨酸突变体溶液与聚乙二醇修饰剂接触 进行修饰反应；
[0104] 3)对修饰反应后得到的混合物进行色谱分离纯化，以除去其中未参与修饰反应的 聚乙二醇修饰剂和未参与修饰反应的所述的干扰素A去半胱氨酸突变体，并除去连接有 多个聚乙二醇分子的干扰素A去半胱氨酸突变体聚乙二醇衍生物。
[0105] 本发明的第四个目的是提供上述干扰素A去半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生 物的药物组合物。
[0106] 在基础的实施方案中，本发明的组合物中含有治疗有效量的所述的干扰素X去 半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生物，以及适宜量的可药用载体。
[0107] 本发明的最后一个目的是提供上述干扰素A去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇衍 生物在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
[0108] 本发明的干扰素X去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇衍生物与未突变的干扰素入 具有相同的目标适应症，由于干扰素对病毒复制的广泛抑制作用，所以它们对几乎所有的 病毒感染性疾病都有疗效，尤其是在治疗呼吸道病毒感染性疾病方面较天然干扰素A分 子具有相当或更好的体内或体外药效。
[0109] 本发明中使用的术语" A干扰素"或"干扰素A "包括人体或动物体中天然存在 或在外界刺激下产生的干扰素A，也包括通过基因工程方法选择适宜的表达载体表达的与 上述天然序列完全相同的重组分子。
[0110] 本发明中使用的术语"聚乙二醇修饰剂"，也即"聚乙二醇修饰剂"是指单甲氧基 聚乙二醇修饰剂，也即用甲氧基封闭聚乙二醇分子一端的一个羟基，而用适宜的活化方法 活化另一端的一个羟基后所得的活化聚乙二醇。由于羟基自身的反应活性很低，所以经过 活化后的聚乙二醇分子的反应活性有了很大的提高，才可被称为"聚乙二醇修饰剂"。关于 活化基团的选择、活化的机理以及活化所得的聚乙二醇修饰剂的修饰反应机理在现有技术 中有很多文献报道，如美国Nektar公司（原Shearwater公司）申请并获得授权了多篇有 关聚乙二醇修饰剂的专利。聚乙二醇修饰剂可通过商业渠道获得或通过已知的活化机理活 化制备，商业渠道获得方面例如从国外Nektar公司购买，从国内包括北京键凯科技有限公 司、北京凯正生物工程发展有限责任公司在内的专业活化聚乙二醇修饰剂的公司购买。
[0111] 本发明中使用的术语"聚乙二醇修饰"是指将聚乙二醇修饰剂分子与蛋白质分子 化学偶联到一起。参与偶联反应的聚乙二醇修饰剂的基团是其在活化过程中引入的活化基 团，蛋白质的基团主要是其中游离的氨基基团、巯基基团、羧基基团或羟基基团。
[0112] 本发明中使用的术语"治疗有效量"表示当施用本发明的药物活性成分干扰素入 去半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生物用于治疗或预防疾病时，药物活性成分的量足以实 现对疾病的治疗或预防。治疗有效量将依药物活性成分、疾病和它的严重性，以及所治疗病 人的年龄、体重等而异。
[0113] 本发明中使用的术语"可药用载体"是指在制剂处方设计时，为解决制剂的溶解 性、有效性、稳定性、安全性等问题，加入到制剂处方中的除药物活性成分以外自身对人体 或动物体安全的其他辅助成分。
【具体实施方式】
[0114] 通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限 于如下的实施例。
[0115] 实施例1 :干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体的表达工程菌构建
[0116] 由上海生工生物工程有限公司合成SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的干扰素入 第112位点去半胱氨酸突变体的基因序列，并将其连接到用Nde I/EcoR I双酶切后的 pET_23b 质粒载体上。连接反应条件为：2XRapid buffer 4_5iil、T4 DNA Lagase lyl、 目的基因序列l_2yl、载体3yl，4°C过夜连接。
[0117] 制备大肠杆菌JM109或DH5 a感受态细胞，转化上述连接产物，涂布氨苄平板， 37 °C过夜培养。
[0118] 实施例2 :干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体的发酵、纯化与检测
[0119] 将用实施例1的方法构建得到大肠杆菌工程菌，经涂平板活化后挑选单菌落接种 于含氨苄青霉素的LB培养基中（每升用蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g配制，调节pH为 7. 0)，37°C、230转/分摇床摇瓶培养至0D_nni为0. 6-0. 8。然后以5 %的体积接种量接种 于50L的LB培养基中在80L发酵罐中进行发酵培养（每升含0. 1 %的氨苄青霉素），培养 温度为37°C，培养过程中用氨水调节pH在6. 5-7. 5之间，用转速控制溶氧值在3-5 %之间。 在〇D6MJi到1. 0后按质量体积比1:5000的比例加入IPTG 10g继续诱导培养3小时，诱 导培养温度为36°C，并在此过程中向发酵罐中适当的补加LB培养基。诱导培养时间到后 放罐室温5000转/分离心20分钟收集菌体，所得菌体用TE缓冲液（50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L EDTA，pH8.0溶液）洗涤离心两次以除去发酵液中的主要杂质。
[0120] 取上述处理得到的菌体40g以1:20的质量体积比加入800ml TE缓冲液置超声波 破碎仪上进行超声破碎，条件为打5秒，歇5秒，共60分钟，所得破碎液室温6000转/分离 心20分钟弃上清，沉淀以1:15的质量体积比加入TE缓冲液洗涤离心两次，得分离包涵体。
[0121] 所得10g包涵体以1:12的质量体积比加入120ml 7mol/L盐酸胍后在适度搅拌条 件下变性处理2小时，待包涵体完全溶解后室温8000转/分离心20分钟弃沉淀，上清以稀 释复性法进行复性处理，复性液组成为：〇. 15mol/L硼酸钠缓冲液，4mmol/L氧化型谷胱甘 肽，lmmol/L还原型谷胱甘肽，调节pH为9. 5。复性过程在2-8°C低温冷库中进行，首先用复 性液将上清稀释4倍，放置8小时后再用复性液稀释5倍继续复性6小时，然后再用复性液 稀释5倍，最后复性6小时以达到最终的复性效果。复性完成后4°C 8000转/分离心复性 液30分钟，取上清按1:10的体积比对25mmol/L Tris-HCl，pH8. 0溶液进行透析处理，透析 时间为12-24小时，中间换透析液1-2次。
[0122] 透析后的复性液经4°C，8000转/分离心30分钟后上用25mmol/L Tris-HCl， pH8. 0溶液平衡的DEAE S印harose FF色谱柱。上样完成后先用平衡缓冲液继续冲洗色谱 柱1-3个柱体积，然后以含有0. 3mol/L NaCl的25mmol/L Tris-HCl，pH8. 0溶液进行洗脱 收集洗脱峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
[0123] DEAE S印harose FF洗脱峰用50mmol/L醋酸-醋酸钠，pH5. 0缓冲液以1:10的体 积比稀释后上用同样缓冲液平衡的CM S印harose FF色谱柱。上样完成后先用平衡缓冲液 继续冲洗色谱柱1-3个柱体积，然后在用含有0. 12-0. 18mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋 酸钠，PH5. 0缓冲液洗脱除去主要杂质峰后用含有0. 5mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋 酸钠，PH5.0缓冲液洗脱收集目标峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在 50-200cm/h 之间。
[0124] 用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测上述CM Sepharose FF色谱柱分离得到的干扰素A第112位点去半胱氨酸突变体的纯度，结果均 在97%以上。用MALDI-T0F质谱法检测其分子量为19989. 01 (还原状态），与理论值偏差 为-0. 58 (还原状态下理论值为19989. 59)。用前述
【发明内容】
部分所述的IfepG2细胞/EMCV 病毒系统的检测方法测定其体外抗病毒活性ED50为0. 086ng/ml，对照测定未突变干扰素 入1的体外抗病毒活性H)50为0. 633ng/ml (其中IfepG2细胞由北京肿瘤医院肿瘤所提供； EMCV 为 ATCC(Lot N0.VR-129B) ;IFN-A1 试验工作对照品为由 R&D Systems 提供；DMEM 培 养基粉末由GIBC0公司提供；胰酶由Invitrogen公司提供；胎牛血清（FBS)由Hyclone公 司