的缓冲液包括但不局限于Tris-HCl、PB，洗涤过程的pH值应控制在7. 0-9. 0 之间。为了溶解较难溶解的疏水蛋白质杂质，可在洗涤缓冲液中加入一定量的盐，常用的为 NaCl，浓度范围在0. 05-0. 5mol/L之间；为了溶解疏水性更强的膜蛋白，可在洗涤缓冲液中 加入一定量的表面活性剂，常用的此类表面活性剂包括但不限于吐温-80、十二烷基磺酸钠 (505)、1^行〇成-100，浓度在0.01-5%之间。
[0021] 由于在破碎过程中菌体或细胞会释放出一些蛋白水解酶，从而有可能降解干扰素 入去半胱氨酸突变体，因此需要在破碎过程中及破碎后的洗涤过程中加入一些物质来抑制 这些蛋白水解酶的活性，最直接的方法是加入蛋白酶抑制剂，如胰蛋白酶抑制剂，间接的方 法也可加入金属离子螯合剂，如m)TA，因为金属离子螯合剂可以螯合这些蛋白水解酶发挥 水解作用所必须依靠的金属离子。
[0022] 洗涤得到的包涵体变性溶解可以使用7-10mol/L的尿素或5-8mol/L的盐酸胍，必 要时还需要加入巯基试剂以提高变性剂的溶解效力，所述的巯基试剂包括但不局限于巯基 乙醇、二硫苏糖醇。溶解所采用的包涵体/变性剂的质量/体积比（g/ml)可以在1:3到 1:50之间，优选的在1:5到1:30之间，最佳的在1:7到1:20之间。变性溶解时间应该在2 小时以上。
[0023] 包涵体复性可以采用稀释复性法、透析复性法或柱上复性法。稀释复性法是通过 一步或多步稀释用复性液将变性剂的浓度稀释到〇. 5mol/L以下，以使蛋白质分子在摆脱 变性剂影响的情况下逐渐复性；透析复性法是用10倍以上体积的复性液对变性液进行透 析以使变性剂的浓度降低到〇. 5mol/L以下，同样起到复性的作用；柱上复性法是将变性液 直接上离子交换、疏水分子排阻（凝胶）色谱柱，然后用含不断降低变性剂浓度的洗脱溶液 进行梯度洗脱以同时实现目标蛋白的分离纯化与复性。
[0024] 复性液的基本组成是pH在5. 0-10. 0之间的缓冲溶液，以保证复性所需的基本碱 性环境，可以满足这种要求的缓冲溶液包括但不局限于Tris-HCl、硼酸钠缓冲液。为了防 止复性过程中复性速度过快形成二硫键错配，需要在复性液中加入一些氧化型和还原型巯 基试剂对组成的氧化还原平衡体系物质，如氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽组成的氧化 还原平衡体系。同时为了防止复性速度过快造成蛋白质折叠不完全、二硫键错配，可以在上 述基本组成的复性液中添加一些其它物质，如精氨酸、H)TA、金属离子及各种分子伴侣物质 等。这些物质的选择及加量在现有技术中有很多报道，本文不再赘述。
[0025] 上述稀释复性法和透析复性法得到的复性液，以及通过破碎直接得到的含有 可溶性形式表达的干扰素A去半胱氨酸突变体的离心上清，以及以可溶性形式表达的 干扰素A去半胱氨酸突变体的发酵培养液离心上清，都需进行进一步的色谱或层析 (chromatography)分离纯化。利用干扰素A去半胱氨酸突变体分子与杂质分子在电荷 性质、疏水性质、亲和性质、分子量大小性质上的差异可以先后选择离子交换色谱（或离 子交换层析，ion exchange chromatography，IEC)、疏水色谱（或疏水层析，hydrophobic interaction chromatography，HIC)、亲和色谱（或亲和层析，affinity chromatography, AF)、凝胶过滤色谱（或凝胶过滤层析，gel filtration chromatography，GFC)中的一种或 几种的组合进行纯化。为了更好的达到分离作用，在色谱或层析分离纯化前可对待分离液 进行浓缩处理，可以选择的方法包括但不局限于有机溶剂沉淀后反溶、盐析后反溶、聚乙二 醇浓缩、超滤及色谱处理等。
[0026] 干扰素X去半胱氨酸突变体蛋白如果为分泌型表达，则需要对发酵液进行固液 分离后的浓缩处理，浓缩处理方法如前段最后部分所述。
[0027] 然后进行色谱或层析分离纯化。利用干扰素X去半胱氨酸突变体与杂质分子在 电荷性质、疏水性质、亲和性质、分子量大小性质上的差异可以先后选择离子交换色谱（或 离子交换层析）、疏水色谱（或疏水层析）、亲和色谱（或亲和层析）、凝胶过滤色谱（或凝 胶过滤层析）中的一种或几种的组合进行纯化。
[0028] 色谱或层析分离纯化获得的干扰素X去半胱氨酸突变体分子可用本领域技术人 员公知的SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法或高效液相色谱法确定纯度。
[0029] 其中高效液相色谱纯度检测法可以采用反相高效液相色谱法或分子排阻高效液 相色谱法，但优选分子排阻高效液相色谱法，因为此种方法更为方便、准确、快捷。采用分子 排阻高效液相色谱法时要求色谱柱的理论板数大于10000,上样量在5-100 y 1之间，优选 10-50 y 1之间，色谱分离时间为主峰出峰时间的3倍。
[0030] 色谱分离纯化获得的干扰素X去半胱氨酸突变体分子可用本领域技术人员公知 的SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法或质谱法确定分子量。
[0031] 色谱分离纯化获得的干扰素X去半胱氨酸突变体分子的体外抗病毒活性可用干 扰素a体外抗病毒活性检测的方法，即《中华人民共和国药典2010年版（三部）》附录X C的"干扰素生物学活性测定法"规定的WISH细胞/VSV病毒系统的检测方法，但更适宜采 用如下灵敏度更高的H印G2细胞/脑心肌炎病毒（EMCV)系统的检测方法。
[0032] 1.培养基、消化液、染色液、脱色液的配制
[0033] DMEM基础培养基：取DMEM培养基粉末1袋倒入三角瓶中，加碳酸氢钠2. 2g，加去 离子水溶解，搅拌器搅拌均匀后（约4h)，定容至1000ml，0. 22 y m滤器过滤除菌，4°C保存。
[0034] DMEM完全培养基：DMEM基础培养基添加8 % FBS，4°C保存。
[0035] DMEM攻毒培养基：DMEM基础培养基添加2 % FBS，4°C保存。
[0036] DMEM冻存培养基：DMEM基础培养基，添加10%的DMS0及30%的FBS。0. 25 %胰 蛋白酶消化液：取胰蛋白酶〇. 25g，NaCl 0. 9g，去离子水溶解定容至100ml，0. 22 ym滤器过 滤除菌，4 °C保存。
[0037] 结晶紫染色液：取结晶紫50mg，加无水乙醇20ml溶解后，加去离子水稀释至 100ml，滤纸过滤。存在棕色试剂瓶中或避光保存。
[0038] 结晶紫脱色液：无水乙醇50ml，乙酸0. 1ml，加去离子至100ml。
[0039] MTT染色液：取MTT 50mg，加PBS溶剂50ml，室温搅拌溶解，用滤纸过滤。保存在 棕色试剂瓶中或避光保存。
[0040] 2.HepG2细胞的传代、冻存
[0041] 2. 1 IfepG2细胞培养和传代
[0042]HepG2细胞用DMEM完全培养基进行培养和传代：细胞生长达到90 %之后，去掉细 胞培养瓶中的培养液，向培养瓶中加入3-5ml 0. 25 %胰蛋白酶消化液，加盖，振荡培养瓶冲 洗细胞单层，洗去培养瓶中细胞碎片、FBS、酚红等杂质后，弃去胰蛋白酶消化液。另添加lml 左右0.25%胰蛋白酶消化液，常温静置，显微镜下观察细胞状态，待细胞周边翘起，立即弃 去消化液，加入DMEM完全培养基。将细胞从壁上小心吹打到培养基中后，小心吹打以使细 胞形成单细胞悬液。以1:2-1:4比例进行传代。
[0043] 2. 2 IfepG2 细胞冻存
[0044] 将细胞制成单细胞悬液后，lOOOrpmX 5min离心后弃上清，细胞沉淀使用DMEM冻 存培养基混悬至终浓度为1 x 106-1 X 107个/ml的悬液，lml/管加至细胞冻存管中。4°C放 置lh，-20°C放置2h，-80°C放置过夜后移至液氮冻存。冻存后每次复苏细胞培养不超过30 代。
[0045] 3.病毒的制备、保存和滴定测定
[0046] 3. 1 EMCV的制备及保存
[0047] 取Vero细胞贴壁生长的培养瓶，去掉培养基，每瓶接种2ml用完全DMEM培养基稀 释为1-5X 10sPFU/ml的EMCV悬液。感染的病毒细胞比值（m. o. i.)为5-15PFU/cell。小 心振荡单层细胞上的病毒悬液，将培养瓶放回孵箱孵育约〇. 5-2h。然后每瓶加入约40ml攻 毒培养基，放回37°C孵箱孵育约10_20min。去掉培养液，放置于约40°C。再将培养基放置 于-20°C使细胞单层冻结，在室温下解冻使细胞破裂，加入约5ml培养基，振荡细胞瓶使细 胞层分散。将含有EMCV的培养液转移到50ml塑料离心管中，约500g离心10min以除去细 胞碎片。将上清液分装到带有螺旋盖的玻璃瓶中冻存于-80°C冰箱。
[0048] 3. 2 EMCV 活力滴定
[0049] 使用Reed-Muench法测定病毒TCID50,具体方法如下：
[0050] 1)将处于对数生长期的细胞制成细胞悬液后，以1-2X105个/ml的细胞浓度接种 入96孔细胞板内，每孔100 y 1。
[0051] 2)使用DMEM攻毒培养基10倍系列稀释病毒。
[0052] 3)接种好的细胞板置于37°C恒温、5% C0J?箱内培养24h后，将长成单层细胞的 培养液倒掉，接种系列稀释的病毒液，每个稀释度设置副孔，每孔1〇〇 y 1。
[0053] 4)37°C恒温、5% C0J?箱内培养24h后，弃去板内液体，每孔加入50 y 1结晶紫染 色液染色30min，清水洗净，烘干后每孔加入100 y 1结晶紫脱色液脱色l-3min。
[0054] 5)置酶标仪570nm波长处测定吸光度，参比波长630nm，计算CPE的孔数。
[0055] 6)采用如下的Reed-Muench公式计算病毒滴度：
[0056] TCID50 = CPE>50 %的病毒稀释度+ (>50 %的百分数-50)八>50 %的百分数-〈50 % 的百分数）Xlgio
[0057] 4.体外抗病毒活性测定
[0058] 4. 1细胞铺板
[0059] HepG2细胞培养至密度约为90%时，消化吹散至单细胞悬液。经血细胞计数板计 数后，以1-5 X 106个/ml细胞浓度，2倍梯度稀释，100 y 1/孔铺置96孔板。于37 °C孵箱培 养48h后，结晶紫染色，读数。绘制HepG2生长曲线。选取细胞生长状态良好，生长旺盛的 密度点作为铺板密度。
[0060] 4. 2试验对照及样品处理
[0061] 试验中通过设立细胞及病毒对照，取两者平均作为检测ED50值，用于试验结果的 计算。另取IFN-A 1试验工作对照品，根据其标识的H)50值进行4倍梯度稀释，设置梯度 范围，确定样品基本稀释值，以保证H)50值的可靠。
[0062] 4. 3添加待测样品
[0063] 参照中国及欧