洲药典干扰素体外抗病毒活性测定方法，分别于细胞铺板时及细胞 铺板后静置培养4h后，加入4倍梯度稀释样品100 y 1/孔。37 °C孵箱培养24h。
[0064] 4. 4 EMCV 攻毒
[0065] 参照中国及欧洲药典，使用滴度为100TCID50的EMCV量。使用Reed-Muench法测 定病毒滴度，确定病毒稀释倍数，使用攻毒培养基配置EMCV攻毒液。弃去96孔板内含测定 样品的培养基，每孔添加100 y 1攻毒液，置于37°c孵箱培养。
[0066] 4. 5染色：攻毒后24h进行
[0067] 1)结晶紫染色
[0068] 弃去96孔板中的上清液，每孔添加染色液50 y 1，室温放置30min后，小心洗去染 色液，风干。每孔添加脱色液100 y 1，室温放置3-5min，用振荡仪混匀lmin。用酶标仪在波 长570nm处测定吸光度，以630nm为参比波长，记录测定结果。
[0069] 2)MTT 染色
[0070] 取96孔板，每孔加入染色液25 y 1，2h后，每孔加入DMF溶剂100 y 1，于37°C、5 % C〇2条件下培养约l〇h。用酶标仪在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
[0071] 4.6数据处理
[0072] 采用ED50值作为活性标定值。数据参照本领域技术人员公知的四参数回归计算 法进行处理：Y= (A_DV(1+(X/C)b)+D。
[0073] 稳定性考察是将色谱分离纯化得到的干扰素X去半胱氨酸突变体溶液在 20_45°C的环境下长期存放3-6个月，在此过程中定期取样观察外观的变化，并检测纯度、 体外抗病毒活性等主要质量控制指标的变化。
[0074] 色谱分离纯化获得的干扰素X去半胱氨酸突变体分子还需进行动物药代动力学 试验评价与动物急性毒性试验评价。
[0075] 本发明的第二个目的是提供如上所述的干扰素A去半胱氨酸突变体的聚乙二醇 修饰衍生物，以在尽可能高的保留干扰素A的抗病毒活性的基础上进一步改善其稳定性， 并延长其体内药代半衰期。
[0076] 为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明的干扰素X去半胱氨酸突变体的聚 乙二醇衍生物由所述的干扰素A去半胱氨酸突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的 聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa - 40KDa之间。
[0077] 为获得所述的聚乙二醇衍生物进行的聚乙二醇修饰反应主要受聚乙二醇修饰剂 的种类、温度、蛋白质浓度、PH、蛋白质/修饰剂质量/摩尔比、搅拌速度、添加剂及修饰反应 时间等因素的影响。
[0078] 蛋白质聚乙二醇修饰剂的种类主要包括修饰蛋白质中N末端氨基酸残基上的游 离氨基的N末端氨基聚乙二醇修饰剂，修饰蛋白质中N末端氨基酸残基上的游离氨基和非 N末端赖氨酸（Lys，K)残基上的游离氨基的普通氨基聚乙二醇修饰剂，以及修饰蛋白质中 未形成二硫键的半胱氨酸（Cys，C)残基上的游离巯基的巯基聚乙二醇修饰剂。由于干扰素 入去半胱氨酸突变体在理论上已经没有未形成二硫键的半胱氨酸残基，即没有游离巯基， 所以修饰干扰素A去半胱氨酸突变体的聚乙二醇修饰剂的种类不包括巯基聚乙二醇修饰 剂。而在N末端氨基聚乙二醇修饰剂和普通氨基聚乙二醇修饰剂中，由于N末端氨基聚乙 二醇修饰剂修饰的氨基酸残基高度特异性的指向N末端的氨基酸残基，而不像普通氨基聚 乙二醇修饰剂可修饰蛋白质中所有有游离氨基的氨基酸残基，所以优选用N末端氨基聚乙 二醇修饰剂修饰本发明所述的干扰素A去半胱氨酸突变体。
[0079] 普通氨基聚乙二醇修饰剂可选择的范围包括但不局限于羧基聚乙二醇修饰 剂（Methoxy PEG Carboxyl，mPEG-COOH)、琥泊酰亚胺碳酸酯聚乙二醇修饰剂（Methoxy PEG Succinimidyl Carbonate，mPEG-SC)、苯并三唑碳酸酯聚乙二醇修饰剂（Methoxy PEG Benzotriazole Carbonate，mPEG-BTC)、琥泊酰亚胺聚乙二醇修饰剂（Methoxy PEG Succinimidyl Succinate，mPEG-SS)、琥 J白酰駿甲基酯聚乙二醇修饰剂（Methoxy PEG Succinimidyl Carboxymethyl Ester，mPEG-SCM)、琥泊酰亚胺丁酸酯聚乙二醇修饰剂 (Methoxy PEG Succinimidyl Butanoate，mPEG_SBA)、琥泊酰亚胺己酸酯聚乙二醇修饰 剂（Methoxy PEG Succinimidyl Hexanoate，mPEG_SHA)、硝基苯碳酸酯聚乙二醇修饰 剂（Methoxy PEG Nitrophenyl Carbonate，mPEG-NPC)、琥I自酰亚胺戊二酯聚乙二醇修 饰剂（Methoxy PEG Succinimidyl Glutarate，mPEG_SG)、Y 形 NHS 酯聚乙二醇修饰剂 (Y-shape PEG NHS Ester，mPEG-Y_NHS)、Y形駿基聚乙二醇修饰剂（Y-shapePEG Carboxyl， mPEG-Y-C00H)。
[0080] N末端氨基聚乙二醇修饰剂可选择的范围包括但不局限于丙醛聚乙二醇修饰剂 (Methoxy PEG Propionaldehyde，mPEG_PALD)、Y 形丙酸聚乙二醇修饰剂（Y-shape PEG Propionaldehyde，mPEG-Y_PALD)、Y 形乙酸聚乙二醇修饰剂（Y-shape PEG Acetaldehyde， mPEG-Y-AALD)〇
[0081] 上述列举的各种聚乙二醇修饰剂的更具体的信息，尤其是化学结构式等信息，可 参阅这些商品化修饰剂供应商的产品手册，例如北京键凯科技有限公司的"聚乙二醇衍生 物产品目录"（可从其公司网站WWW.jenkem. com下载，最新为2013REV05版本）。
[0082] 上述聚乙二醇修饰剂的分子量可在5KDa - 40KDa之间，但由于低分子量的聚乙二 醇修饰剂对延长干扰素a半衰期的作用不明显，高分子量的聚乙二醇修饰剂修饰干扰素 a后使其生物活性下降严重，因此优选的聚乙二醇修饰剂的分子量在10KDa_20KDa之间。
[0083] 修饰过程中提高温度可以提高修饰反应的速度，但同时也会加快修饰剂的水解 或氧化速度，还不利于干扰素A去半胱氨酸突变体的稳定，因此适宜的修饰反应温度为 2-40°C，优选的修饰反应温度为2-25°C，最优的修饰反应温度为2-10°C。
[0084] 修饰过程中提高蛋白质浓度可以提高修饰反应的速度，但不利于蛋白质的稳定， 因此适宜的干扰素A去半胱氨酸突变体的浓度为2-20mg/ml，优选的浓度为l-10mg/ml，最 优的浓度为2-5mg/ml。
[0085] 为了达到这一蛋白质浓度，需要对干扰素X去半胱氨酸突变体进行浓缩，同时也 可将pH和缓冲溶液转换到所需。常用的浓缩方法包括但不限于有机溶剂沉淀后反溶、盐析 后反溶、超滤、聚乙二醇浓缩、色谱分离等。
[0086] 修饰过程中需要的pH与修饰反应的机理有关，也关系修饰反应速度和特异性。对 于N末端氨基聚乙二醇修饰剂，修饰反应的pH应控制在4. 0-7. 0之间，优选5. 0-6. 0之间； 对于普通氨基聚乙二醇修饰剂，修饰反应的pH应控制在7. 0-10. 0之间，优选8. 0-9. 0之 间。
[0087] 修饰过程中提高或降低蛋白质/修饰剂质量或摩尔比均可以提高反应速度。从 提高聚乙二醇修饰剂利用率的角度考虑应该增加投入反应的干扰素A去半胱氨酸突变体 的量，而从提高干扰素A去半胱氨酸突变体转化率的角度考虑则应该增加投入反应的聚 乙二醇修饰剂的量，具体如何处理应视具体情况决定（优先考虑修饰剂的利用率还是优先 考虑蛋白质的利用率，很大程度上取决于两者的成本比），但一般情况下适宜的比值应在 1:8-8:1之间，优选的比值在1:4-4:1之间，最优的比值在1:2-2:1之间。
[0088] 修饰过程中增加搅拌可以提高修饰反应的速度，尤其是对于从修饰机理上来说反 应速度较慢的修饰反应。但过快的搅拌对蛋白质的稳定不利，同时也无法进一步加速修饰 反应的速度，因此适宜的修饰反应搅拌速度在0-40转/分之间，优选的速度在1-20转/分 之间，最优的速度在2-10转/分之间。
[0089] 修饰过程中添加某些物质或在蛋白质缓冲溶液中存在某些物质也会影响修饰反 应的速度，如添加某些类型的表面活性剂或在蛋白质缓冲溶液中存在高浓度的NaCl，但具 体影响规律由于添加与存在物质种类众多，可选择浓度范围宽，所以不能一概加以论述，需 要具体问题具体研究。
[0090] 修饰反应的时间与上述各影响因素均有关，一般来说延长修饰反应时间均可提高 修饰反应得率，但时间超过某一临界值后这一规律会变得不明显，且还会对干扰素A去半 胱氨酸突变体的稳定不利，会降低反应过程的经济效益，因此适宜的修饰反应时间在1-48 小时之间，优选的时间在2-24小时之间，最优的时间在5-20小时之间。
[0091] 从原理上讲修饰反应终止后修饰反应混合物中含有未参与修饰反应的聚乙二醇 修饰剂、未被修饰的干扰素A去半胱氨酸突变体、单位点修饰的干扰素A去半胱氨酸突变 体及少量多位点修饰的干扰素A去半胱氨酸突变体，必须通过后续的分离纯化过程除去 单位点聚乙二醇修饰的干扰素A去半胱氨酸突变体以外的成分。
[0092] 利用目标单位点聚乙二醇修饰的干扰素X去半胱氨酸突变体分子与杂 质分子在分子量上有明显差异的特点，可以采用凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography, GFC)或分子排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC)对它们 进行分离，可以采用的填料包括但不限于Sephacryl S-100、Sephacryl S-200、Sephadex G-25、S印hadex G-50、S印hadex G-75、Superdex 75、TSKgel Hff-50、TSKgel Hff-55 等。
[0093] 由于包括N末端氨基聚乙二醇修饰剂在内的氨基聚乙二醇修饰剂修饰的是蛋 白质有游离氨基的氨基酸残基，修饰后会使蛋白质失去带正电的可解离基团，且有可能 掩蔽蛋白质的其它带电基团，而连接分子量越大的修饰剂或连接较多个数的修饰剂分子 的后一效应越明显。因此可以利用修饰前后蛋白质分子这一电荷性质的改变对目标单 位点聚乙二醇修饰的干扰素A去半胱氨酸突变体分子与杂质进行离子交换色谱（ion exchange chromatography, IEC)分离，可以米用的填料包括但不限于DEAE Sepharose FF、 Q Sepharose FF、CM Sepharose FF、SP Sepharose FF、DEAE Sepharose CL_6B、Source 15、 Source 30、TSKgel CM-650、TSKgel DEAE-650、TSKgel QAE-550、TSKgel SP-650、TSK