一种镍-极低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重金属离子的免疫学检测，具体涉及一种镍-极低密度脂蛋白螯合物 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白质与脂质结合所形成的一种脂质-蛋白质复 合物，按密度分为高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，简称HDL)、中间密度脂 蛋白（intermediatedensitylipoprotein，简称IDL)、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，简称LDL)、极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,简称VLDL)、 乳糜颗粒（chylomicron，CM)。血液中大约百分之三十的胆固醇是通过HDL从组织细胞中 运输到肝脏转化为胆汁酸或通过胆汁排出体外的。血液中约70%的胆固醇由LDL和VLDL 所携带，肝脏中产生的内源性甘油三酯（triglyceride，TG)也主要依靠VLDL运输至肝外。 VLDL的增多与高脂血症、脂代谢紊乱息息相关，而血脂异常又是多种疾病发生的重要危险 因素，因而VLDL含量水平的稳定对于人体各方面机能功能的稳定起着重要作用。
[0003] VLDL含量水平及结构功能的稳定对机体意义重大。其含量过高与脂肪肝、脂代谢 紊乱、心血管疾病、肾脏功能损伤等息息相关。定量检测VLDL可以用于这些疾病的早期诊 断以及治疗效果监测，甚至作为预后好坏的评价指标之一。而对于营养不良、慢性贫血、肝 功能受损者等患者，血清VLDL含量也会下降，定量检测VLDL也可用于这些疾病的早期诊 断、治疗效果监测以及作为预后评价的指标之一。
[0004] 镍（Nickel，Ni)与人体的健康息息相关，首先其是人体维持健康所必需的微量元 素，其存在于多种氢化酶中，催化氢的氧化还原反应，参与多种酶蛋白的合成和细胞激素及 色素的代谢，具有促进铁的吸收和红细胞的增长、激活酶形成辅酶、增强胰岛素、降血糖、保 护心血管等作用，因此如果人体缺乏镍，会导致疾病的发生。但是，事实在生活中，由于环境 污染，人体内很少缺乏镍，相反镍的含量常常过量，常常导致疾病的发生，甚至危及生命。
[0005] 然镍螯合于极低密度脂蛋白上的机制尚不清楚，两者之间的相互作用及对机体的 影响也尚待研究。但是可以明确的，极低密度脂蛋白和镍对于机体的作用都至关重要，而定 量检测极低密度脂蛋白上螯合镍是研究两者相互关系的第一步，其具有重要科研及临床价 值。
【发明内容】
[0006] 针对镍污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种镍-极低密度脂蛋白螯合物 及其制备方法，并建立镍-极低密度脂蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测 镍-极低密度脂蛋白螯合物在评价一个地区镍污染程度的应用。通过定量检测一个地区人 群血清中镍-极低密度脂蛋白螯合物，可以间接反映这个地区人群受镍污染的情况，从而 间接反映这个地区镍污染程度。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种镍-极低密度脂蛋白螯合 物，该镍-极低密度脂蛋白螯合物是镍离子与极低密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残 基螯合而成。
[0008] 本发明还提供一种上述的镍_极低密度脂蛋白螯合物的制备方法，即体外合成 法，包括以下步骤：
[0009] A)镍-极低密度脂蛋白螯合物的合成：在提纯源于人体的极低密度脂蛋白或按照 生物学方法重组的极低密度脂蛋白中加入镍离子进行螯合反应，得到反应溶液；
[0010] B)镍-极低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液 中未反应的极低密度脂蛋白、特异性抗体和镍离子，即得镍-极低密度脂蛋白螯合物。
[0011] 作为优选，所述步骤B)中具体包括以下步骤：
[0012] (1)溶解样品：将上述步骤A)的镍-极低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中， 得镍-极低密度脂蛋白螯合物的溶液；
[0013] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与极低 密度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0014] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，使极低 密度脂蛋白与填料特异性结合；
[0015] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0016] (5)收集：收集步骤（4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0017] (6)透析：将步骤（5)的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后，4°C透 析过夜，收集样本；
[0018](7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与镍特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0019] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
[0020] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0021] (10)收集：收集步骤（9)洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0022] (11)透析：将步骤（10)的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后，4°C 透析过夜，收集样本，即得镍-极低密度脂蛋白螯合物。
[0023] 作为优选，上述镍-极低密度脂蛋白螯合物的制备方法，还包括以下对镍-极低密 度脂蛋白螯合物的鉴定步骤，具体包括以下步骤：
[0024] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0025] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的镍-极低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓 冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0026] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0027] (4)检测：在胶床上找出含有镍的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶 解，然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有镍以及检测镍的含量。
[0028] 本发明还提供一种如上述的镍-极低密度脂蛋白螯合物在制备检测人体内镍-极 低密度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
[0029] 本发明还提供一种至少包括如上述的镍-极低密度脂蛋白螯合物作为标准品的 试剂盒。
[0030] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获极低密度脂蛋白的物质或 捕获金属镍的物质。
[0031] 本发明还提供一种定量检测镍-极低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上 述的镍_极低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免 疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯 镍-极低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯镍-极低密度脂蛋白螯合物与原子吸 收光谱结合法、提纯镍-极低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与 酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
[0032] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0033] 1.本发明首次合成了镍-极低密度脂蛋白螯合物；
[0034] 2.本发明首次提出镍-极低密度脂蛋白螯合物可用于制备检测血样中镍_极低密 度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用；
[0035] 3.本发明实现了镍-极低密度脂蛋白螯合物的特异性识别和定量检测，以便定量 检测人群血清中镍-极低密度脂蛋白螯合物的含量，以评价一个地区镍污染程度的应用， 为工业地区的镍污染水平提供间接指标。本发明建立的镍-极低密度脂蛋白螯合物定量检 测方法的准确度高、重复性好。
【附图说明】
[0036] 图1为本发明所述的镍-极低密度脂蛋白螯合物的非变性电泳蛋白条带图；
[0037] 图2为本发明所述的镍-极低密度脂蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光 分析图。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0039] 本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤；所用试剂、材 料如未特殊说明，均视为可从市购方式购得：
[0040] 提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0041] 捕获极低密度脂蛋白的物质为抗极低密度脂蛋白抗体，可通过市售获得，以下实 施例中，使用的抗极低密度脂蛋白抗体为"Genetexgtxl6419"的VLDLantibody，所述与极 低密度脂蛋白特异性结合的物质、抗极低密度脂蛋白抗体、抗VLDL抗体均为捕获极低密度 脂蛋白的物质；
[0042] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0043] 稀释缓冲液为pH9. 6的0. 05M碳酸盐缓冲液，配制方法示例：取I. 5g的Na2COjP 2. 93g的NaHCO3溶解加CldH2O定容至1000 mL;
[0044] 洗涤缓冲液为pH7. 4的0? 15MPBS溶液，配制方法示例：取0? 2g的KH2P04、2. 90g 的Na2HPO4 ? 12H20、8.Og的NaCl、0. 2g的KC1、0. 5mLTween-20,溶解加ddH20 定容至1000 mL;
[0045] 封闭液为牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0.Ig牛血清白蛋白，加入洗涤缓 冲液稀释定容至IOOmL;
[0046] 终止液为2MH2SO4,配制方法示例：取178. 3mL的ddH20,加浓H2SO4定容至200mL;
[0047] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液，配制方法示例：取0. 5mL浓度为2g/L的甲基联苯 胺乙醇溶液，加底物稀释液稀释至IOmL;
[0048]底物缓冲液pH为5. 0，其中Na2HPO4的摩尔浓度为0. 2M、柠檬酸的摩尔浓度为 0. 1M，配制方法示例：取I. 42gNa2HP04、0. 96g柠檬酸，然后加入CldH2O至50mL，即得；
[0049] 洗脱液的配制方法示例：将木瓜蛋白酶用pH8. 0, 0.lmol/LTris-HCI缓冲液配 制成l-2mg/mL，再加入lmmol/L二硫苏糖醇（DTT)37°C孵育30min，得洗脱液；