由于脯氨酸残基突变而具有降低的致敏性的禾本科的第6组过敏原的变异体的制作方法
【专利说明】由于脯氨酸残基突变而具有降低的致敏性的禾本科的第6 组过敏原的变异体
[0001] 本申请是国际申请日为2010年12月17日、国际申请号为PCT/EP2010/007745、进 入国家阶段的申请号为201080061391. 8、发明名称为"由于脯氨酸残基突变而具有降低的 致敏性的禾本科的第6组过敏原的变异体"的PCT申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及彦衣第6组过敏原的重组变体的制备和用途，其特征在 于相对于已知野生型过敏原的降低的IgE反应性以及同时很大程度地保持与T淋巴细胞的 反应性。
[0003] 可以采用这些低过敏性过敏原变体用于患有草花粉过敏的患者的特异性免疫治 疗(脱敏）或者用于防止形成草花粉过敏的预防性治疗。
[0004] 本发明一个优选的实施方式涉及梯牧草（/似6>?jOratease)的过敏原Phlp6的 变体，其中29、30、57、79位的脯氨酸被单独或组合突变。
【背景技术】
[0005] 1型过敏具有全球重要性。在工业化国家最高至20%的人口受疾病如过敏性的鼻炎、 结膜炎或支气管哮喘之苦。
[0006] 这些过敏由各种源头如树和草(花粉)、真菌(孢子)、螨虫(排泄物)、猫或狗的来源 引起。这些过敏源被直接释放进入空气(花粉、孢子）或可以与柴油炭黑颗粒(草花粉）或室 内灰尘(螨排泄物、皮肤颗粒、毛发）相结合进入空气。由于引发过敏的物质位于空气中，所 以也被称作气源性过敏原。
[0007] 1型引发过敏物质是蛋白质、糖蛋白或多肽。在经由粘膜摄取后，这些过敏原与结 合在敏感人的肥大细胞表面的IgE分子反应。如果这些IgE分子通过过敏原彼此交联，这 导致通过效应细胞分泌介质（例如组胺、前列腺素类）和细胞因子，并因此导致相应的过敏 症状。
[0008] 最高40%的1型过敏患者表现出与禾本科的花粉提取物的特异性IgE反应性 (Burney等，1997，J.AllergyClin.Immunol. 99:314-322;D'Amato等，1998，Allergy 53: 567-578;Freidhoff等，1986，J.AllergyClinImmunology，78，1190_2002)。禾 本科科包括超过10000种，其中迄今已知远超过20种为过敏症状的触发物 (Andersson&Lidholm,2003,Int.Arch.AllergyImmunol. 130:87-107;Esch，2008， AllergensandAllergenImmunotherapy,ClinicalAllergyandImmunologySeries， 107-126)〇
[0009] 大部分的引发过敏的禾本科属于早熟禾亚科亚科。除了以野生形式存在的草 种，例如，绒毛草（故Janatos)、水藹草（/3AaJari1S1a识/a(ica)、黄花茅（Anthoxanthum odoratum)、鸭茅草甸羊茅/Trateasis)、草地早熟禾 QPoapratensis')WL黑轰莫XLoliuinperenne)，姨墙洛物，如小麦{.Triticumaestivund、,黑麦(SecaJecereaJe)和丈麦(/forofe?n/j^are)，也是该亚科的已知成员。
[0010] 关于其过敏原已经被研究得最透彻的早熟禾亚科（Pooideae)种之一是梯牧草 jOratease)，它作为野生植物在世界范围广泛分布，并且作为牧草植物和耐寒的饲 料草发挥了商业作用。
[0011] 取决于各过敏原分子与过敏症患者的IgE抗体反应在人群中的相对频率，区分为 主要-和次要过敏原。
[0012] 六种梯牧草的过敏原可以被视为主要的过敏原：PhlpI(Petersen等，1993， J.AllergyClin.Immunol. 92: 789-796)、Phlp5(Matthiesen和LSwenstein，1991， Clin.Exp.Allergy21: 297-307;Petersen等，1992，Int.Arch.AllergyImmunol. 98: 105-109)、Phlp6(Petersen等，1995,Int.Arch.AllergyImmunol. 108,49-54)、 ?111?2/3(0〇16。61^等，1993，卩￡85 335 (3):299-304)、？111?4〇^&￥11^等，1985，111七 Arch.AllergyAppI.Immunol. 78: 260-268;Valenta等，1992，Int.Arch.Allergy Immunol. 97: 287-294;Nandy等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2005, 337 (2): 563-70)和Phlp13(Suck等，2000，Clin.Exp.Allergy30: 1395-1402)。
[0013] Phlp6的第一次描述早在1978年已进行。从梯牧草花粉纯化的一个蛋白质组分 被称为"Agl9"，包含约15kDa大小的过敏原，其后来在正式的过敏原命名分类中被分类， 并作为Phlp6 继续使用（L0wenstein，1978，Allergy33: 30-41;WH0/IUIS过敏原分类 命名委员会，www.allergen,org)。Phlp6被归类为主要过敏原，因为Phlp6反应性IgE 抗体可以在约70%的草花粉过敏患者中检测到（Rossi等，2001，Allergy，56: 1180-85; Vrtala等，1999,J.Immunol. 15; 163:5489-9) 〇
[0014] 通过对来自草花粉提取物的过敏原的物理化学研究可证实一级序列不同的两种 蛋白变体（Blume等，2004，Proteomics4: 1366-71).这些异构体是归因于在梯牧草花粉 表达文库中经鉴别的两个cDNA序列，并且具有WHO/IUIS命名为Phlp6. 0101 (GenBank: 227082.1;1]111?1(^:?43215;见图15和16或5￡〇10勵：3和5￡〇10勵：4，带前肽的见 图 19 或SEQIDNO:9;Petersen等，1995，Int.Arch.AllergyImmunol. 108: 55-59) 和Phlp6.0102 (GenBank:Y16955;UniProt: 065868;见图 3和 4或SEQIDN0:1 和 SEQIDNO: 2,带前肽的见图 20 或SEQIDN0:10;Vrtala等，1999,J.Immunol. 15; 163:5489-9)。除了信号肽，所述蛋白质各由110个氨基酸组成，且仅在两个位置不同（Val 14-Ile和Arg95 -His，由成熟的Phlp6. 0101开始），这导致了 5Da的分子量的差异 (Phip6. 0101 的 11790Da相对于Phlp6. 0102 的 11785Da，图 1)。
[0015] 禾本科、尤其是早熟禾亚科的其它禾本科种的花粉可包含与梯牧草的过敏原同源 的主要过敏原。在种间存在的这种过敏原被概括为过敏原组。最终基于相似的氨基酸序列 的这种近缘的过敏原的高结构同源性相应地造成分子与IgE抗体的高交叉反应性（Lorenz 等，2009，Int.Arch.Immunol. 148:1-17)。还已知，对梯牧草的主要过敏原过敏性反应的 遗传性过敏症患者会主要由梯牧草的其他近缘物种之一致敏。最后，由于这种交叉反应，能 够通过一种草种的致敏足以引发对其他近缘草的过敏反应。
[0016] 在草地早熟禾（/??jOrateasis)的花粉中已在蛋白质水平证明了与Phlp6交叉 反应的第 6 组过敏原（Vrtala等，1999,J.Immunol. 15; 163:5489-9;Niederberger等， 1998,J.AllergyClin.Immunol. 101 (2): 258-264)〇
[0017] 除了第6组过敏原相互间的交叉反应性，还已知与第5组的主要过敏原的交叉 反应性。Phl p 6的多肽链表现出与Phl p 5的N-末端约26-28 kDa大小的区域大的相 似性（图1、图2)。据估计，过敏原可以归因为共同的初始基因（Petersen等，1995，Int. Arch. Allergy Immunol. 108:55-59)。这两种蛋白质均形成a-螺旋的二级结构，但没有形 成折叠结构。X-射线结构分析表明，Phl p 6的四个a-螺旋折叠成了独特的螺旋束 (RCSB蛋白质数据库条目：1NLX; Fedorov等，2003 ;2003;图1)，一种在Phl p 5的片段中 也能被证明的结构（Rajashankar等，2002，Acta Cryst. D58:1175_1181; Maglio等，2002， Protein Engineering 15: 635-642; Wald等，2007，Clin. Exp. Allergy 37:441-450). 过敏原间的相似性导致Phl p 5-反应性IgE抗体也结合在Phl p 6上（Petersen等，1995， Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 49-54; Andersson & Lidholm,2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107)。
[0018] 特异性免疫治疗（SIT)或脱敏被视为过敏的治疗处理的有效方法（Fiebig1995 AllergoJ. 4 (6) :336-339，Bousquet等，1998，J.AllergyClin.Immunol. 102 (4): 558-562;Cox等，2007,J.AllergyClin.Immunol. 120:S25-85;James&Durham，2008， Clin.Exp.Allergy38: 1074-1088)。
[0019] 近百年来，注射疗法的传统治疗形式（SCIT)(其中将天然的过敏原提取物以逐渐 增加的剂量皮下注入患者）已成功使用。在该疗法中，过敏症患者的免疫系统一再被迫面 对过敏原，由此获得了与对过敏原的耐受性相联系的免疫系统的重新编程。在通过抗原递 呈细胞摄取得自过敏原制备物的抗原后，抗原的多肽被递呈至细胞表面上。一些包含所谓 的T细胞表位的特定肽被抗原特异性T细胞识别。这种结合尤其导致各种类型的具有调节 功能的T细胞的形成。在SIT期间，调节性T细胞应答导致对过敏原的耐受、TH2细胞因子 的下调、TH1/TH2平衡的恢复、过敏原特异性IgE的抑制，IgG4、IgGl和IgA抗体的诱导、效 应细胞(肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞）的抑制以及炎症组织的更新（Akdis等， 2007,J.AllergyClin.Immunol. 119 (4):780-789;Larchfe等，2008，NatureReviews 6:761-771)。因此T细胞表位对于过敏原制备物在脱敏时的治疗作用至关重要。
[0020] 由于存在于IgE和也存在于T细胞水平的梯牧草的主要过敏原的交叉反应性， 用单一代表性的草种的过敏原提取物的成功治疗通常是足够的（Mailing等，1993,EAACI PositionPaper:Immunotherapy,Allergy48: 9-35;Cox等，2007，JAllergyClin Immunol120: 25-85)。
[0021] 除了皮下免疫治疗，舌下治疗形式(其中过敏原或过敏原衍