一种溶解难溶多肽的偶联肽链及其在液相色谱中分离纯化的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程和多肽生产领域，具体的说涉及一种溶解难溶多肽的偶联肽 链及其在液相色谱中分离纯化的应用。
【背景技术】
[0002] 溶解性是研究蛋白质和多肽会遇到比较重要的问题，每个氨基酸都有其固有的化 学特性。如亮氨酸、异亮氨酸、颉氨酸是疏水性的，而赖氨酸、组氨酸、精氨酸是亲水性的。难 溶多肽主要是其包含的难溶氨基酸引起的，一般来说，难溶氨基酸占多肽比例超过75 %就 会造成多肽的难溶。
[0003] 在多肽生产和制备方面，难溶性一直是多肽分离纯化步骤的一大难题。多肽主要 的纯化手段是反相高效液相色谱，其具有分离效果好，分辨率高回收率高的特点。反相高效 液相色谱在对多肽进行分离纯化时，需要将多肽完全溶解到溶剂中，最适合的常规溶剂为 H20、ACN，这样才能利用反相高效液相色谱进行有效的分离纯化，但难溶多肽给广大科研人 员在该操作带来极大麻烦。
[0004] 现有解决难溶多肽纯化的方法只能选择优良的有机溶剂（如：DMSO,DMF)去溶解 多肽，然后进行反相高效液相色谱分离纯化。而DMF或DMSO是通过破坏多肽的二级结构助 溶，会导致高效液相色谱分离效果大大降低，且对难容肽链的溶解能力有限。
【发明内容】
[0005] 发明目的：本发明的目的是提供一种用于溶解难溶多肽的的偶联肽链；本发明还 有一个目的是提供前述偶联肽链在溶解难溶多肽上的应用。
[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种溶解难溶多肽的偶联肽链如式 (I)所示：
[0007] X-Ph-Y- (B)n (I)，
[0008] 其中，Ph表示1，4位被取代的苯环；
[0009] X表示羟基或C1-C4的单羟基烷基；
[0010] Y表示与（B)n发生脱水缩合反应后形成的羰基或C2~C4羰基烷基；
[0011] (B)n表示n个相同或不同的亲水氨基酸缩合组成的亲水多肽链，n为难溶多肽氨 基酸数的1. 2~2倍。
[0012] 具体地说，式（I)所述X为直链或支链的-ch2oh、-ch2ch2oh、-ch2ch2ch2oh、-CH2CH2CH2CH2OH的任意一种；所述Y为直链或支链的-CH2CO-、-CH2CH2CO-或-CH2CH2CH2CO-的任意一种。
[0013] X-Ph-Y原本来自于1，4位分别被单羟基烷基和单羧基烷基取代的苯环。羧基 的-OH与（B)n的氨基脱水缩合形成肽链，因此通式（I)的Y为直链或支链的-CH2CO-、-CH2CH2CO-或-CH2CH2CH2CO-的任意一种。
[0014] 本发明的耦合肽链中，X - Ph - Y是将亲水多肽链和难溶多肽链耦合的"连接臂"， 该"连接臂"来自4-羟基苯甲酸、对羟甲基苯甲酸、4-(2-羟乙基）苯甲酸、4-(3-羟基丙 基）苯甲酸、4-(4-羟基丁基）苯甲酸、对羟基苯乙酸、4-(羟甲基）苯乙酸、对羟基苯丙酸、 3-[4-(羟基甲基）苯基]丙酸、4-(4-羟基苯基）丁酸、2-(4-羟基苯）丙酸、3-(4-羟基苯 基）丁酸、2-[(4_羟基苯基）甲基]氨基丁酸、4-(1-羟基乙基）-苯甲酸的任意一种，通过 脱水缩合反应与亲水多肽链的N端连接。
[0015] 另外，本发明的耦合肽链中，亲水氨基酸包括但不限于精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、 天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸中的任意一种，这些氨基酸如下表1所示，疏 水参数很小；而所述的难溶多肽链，可以理解为包含难溶氨基酸且在液相色谱中溶解度很 低或难溶的多肽链，难溶氨基酸包括丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸的任意一种，这些氨基酸如表2所示，疏水参数大，含有这些氨基酸的多肽链一般 溶解度都非常低。
[0021] 上述难溶多肽链一般是肽链合成中的目标产物，而亲水多肽链和连接臂可结合生 产实践进行优选。作为本发明的进一步优化，所述X-Ph-Y来自4-羟基苯甲酸、对羟甲基苯 甲酸、4-(2-羟乙基）苯甲酸、对羟基苯乙酸、4_(羟甲基）苯乙酸的任意一种，通过脱水缩 合反应与亲水多肽链的N端连接。亲水多肽链中的亲水氨基酸优选谷氨酸或天冬氨酸。当 谷氨酸和/或天冬氨酸总数目占总亲水氨基酸数目的30%~80%时，利用X-Ph-Y-(B) "在 液相色谱中分离纯化，最后再水解酯键的效果最好。
[0022] 本发明利用上述偶联肽链进行分离纯化的步骤如下：
[0023] (1)通过固相合成法先合成亲水多肽链，再合成连接臂和难溶多肽链，经过处理后 获得难溶多肽链-连接臂-亲水多肽链粗品；
[0024] (2)将上述产品用水/乙腈溶解，于高效液相色谱装样进行分离提纯，真空冷冻干 燥，获得纯品；
[0025] (3)将上述纯品用LiOH饱和溶液进行酯键水解，常温下反应3小时后，目标多肽链 析出，过滤干燥后获得成品。
[0026] 由于X-Ph-Y-(B)n的亲水性强，且肽链多呈酸性，在溶解在LiOH中的效果非常突 出。而亲水多肽链中谷氨酸、天冬氨酸含量高的话，利于亲水多肽链在碱性溶液中的溶解， 提高目标多肽链的析出效果。
[0027] 本发明中一些常用缩写及其含义如下：
[0028] HMBA 4_羟甲基苯甲酸，连接臂；
[0029] DIC N，N'-二异丙基碳二亚胺，缩合剂；
[0030] DMAP 4-二甲氨基吡啶，作为超强亲核催化剂，增加羟基与羧基链接效率；
[0031] HOBT 1-羟基苯并三唑，用于防止消旋反应，减少副反应；
[0032] DMF二甲基甲酰胺，反应溶剂；
[0033] TFA 三氟乙酸，用于裂解多肽与树脂；
[0034] TIS 三异丙基硅烷，用于更好地去除氨基酸保护基团；
[0035]EDT 乙二硫醇，用于更好地去除氨基酸保护基团；
[0036]ACN 乙腈，增加多肽在水溶液的溶剂度；
[0037] Fmoc N-荷甲氧羰基，官能团保护基团；
[0038] Pbf [(2, 3-二氢-2, 2, 4, 6, 7-五甲基苯并呋喃-5-基）磺酰基，a-氨基保护基团；
[0039] Boc 叔丁氧羰基，a-氨基保护基团；
[0040] Trt 三苯甲基，a-氨基保护基团；
[0041] Otbu 叔丁酯，a-氨基保护基团
[0042] 有益效果：本发明提供了一种利用特殊连接臂将亲水多肽链与难溶多肽链连接的 方案，解决了难溶多肽链在液相色谱中无法操作的问题。本发明的耦合肽链既可以在生产、 试验中通过固相合成法合成，也可作作为定制产品为目标肽链的生产提供服务。尤其是本 发明针对液相色谱分离提纯环境的特点，优化了亲水氨基酸的组合，最后利用酯键水解断 开难溶多肽链和亲水多肽链，使目标肽链直接析出，具有简易、高效的特点，用该方法获得 的难溶多肽产品完全可以达到客户要求标准。
【附图说明】 图1是本发明实施例1的多肽合成步骤流程示意图； 图2是本发明实施例2的多肽合成步骤流程示意图。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0044] 实施例1
[0045] 本实施例针对难溶多肽ILVLLIII进行分离纯化，连接臂选用4-羟甲基苯甲酸 (HMBA)，通过连接臂连接DDDDDEEKEEEE亲水多肽链。其中，D表示天冬氨酸，疏水参数-3. 5， 利用OtBu保护官能团；E表示谷氨酸，疏水参数-3. 5,利用OtBu保护官能团，K表示赖氨酸， 疏水参数-3. 9,利用Boc保护官能团；这些氨基酸都采用Fmoc保护a-氨基进行固相合成。 如图1所示，具体合成步骤如下：
[0046] 称取IgFmoc-Glu(OtBu)-Wangresin树脂，执行[操作A]，即：加入哌啶：DMF= 1:4 (体积比）移除N端的Fmoc保护基团，温度控制在30 °C，反应20分钟，反应后利用DMF/ 甲醇各洗涤3次，利用茚三酮检测试剂检测，颜色为蓝色表示反应完全。
[0047] 然后执行[操作B]，S卩：加入初始树脂摩尔数两倍的DIC和H0BT，以及两倍量的具 有保护基团的氨基酸反应1小时，温度控制在30°C，反应结束后用DMF洗涤3次后，用茚三 酮检测颜色为无色，则说明反应完全。
[0048] 后续以[操作A]、[操作B]交替进行，只是在[操作B]中所加入的亲氨基 酸随着合成顺序的进行更换。其中具有保护基团的谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸分别为 Fmoc-Glu(OtBu) -OH、Fmoc-Asp(OtBu) -OH、Fmoc-Lys(Boc) -0H。如此反应直到连接完HMBA， 用茚三酮溶