一种制备依替巴肽的新型还原-氧化体系的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种制备依替巴肽的新型还原-氧化体系。
【背景技术】
[0002] 依替巴肽是由美国CORTherapeutics(C0R治疗）公司和美国Schering-Plough (先灵葆雅）公司共同研制开发，1998年5月18日美国FDA批准Schering生产上市。1999 年在欧盟，2001年阿根廷，香港，泰国陆续推出。2012年10月30国家食品药品监督管理 总局批准江苏豪森医药股份有限公司生产依替巴肽原料药（国药准字H20120092)和依替 巴肽注射液（国药准字H20120093)，用于急性冠状动脉综合症患者的治疗（不稳定型心绞 痛/非ST段抬高性心肌梗死），包括即将接受药物治疗的患者以及接受经皮冠脉介入治疗 (PCI)的患者；接受PCI治疗的患者，包括接受冠状动脉内支架置入术的患者。
[0003] 随着急性冠脉综合征（acutecoronarysyndrome，ACS)概念的提出和发病机制 的阐述，抗血小板药物在冠心病心肌缺血（心绞痛、心肌梗死）的治疗中发挥越来越重要的 作用，在这些药物中阿昔单抗（abciximab)、替罗非班（tirofiban)、拉米非班（Iamifiban) 和依替巴肽起相同的作用，但是依替巴肽具有起效快、作用时间长、选择性高、为可逆性抑 制的优点。
[0004] 依替巴肽是环状的七肽，含有6个氨基酸和1个巯基丙酰基(脱氨基半胱氨酰）残 基，其中半胱氨酸酰胺和巯基丙酰基部分之间形成链间的二硫键。其结构如下：
目前依替巴肽的制备可由常规的固相合成法或在液相中进行片段缩合法制备。中国专 利CN 101538316B公开了一种以Fmoc-Cys (Acm)-OH、Mpa (Acm)-OH作为起始原料，以 Sieber树脂为固相载体合成侧链全保护线性肽Eptifibatide-Sieber树脂，然后进行树 脂固相氧化，得到侧链全保护氧化肽Eptifibatide-Sieber树脂，此方法虽简便，但操作步 骤较多、具体过程繁琐，且收率较低；专利CN 1858060与专利CN101838308 A均公开了先 通过固相合成依替巴肽线性肽肽树脂，然后裂解得到线性肽后，经液相中直接氧化形成二 硫键，但此类方法所得的粗肽中均存在大量的二聚体杂质，这些二聚体杂质不仅造成原料 成本的大量浪费，而且不易纯化除去，影响产品收率。
[0005] 本发明针对依替巴肽在合成过程中容易产生多种杂质，特别是由于二聚体杂质 (两条线性肽以二硫键相连）的产生导致粗肽的纯化难度高，收率低等问题，提供了一种新 型还原-氧化体系制备依替巴肽的技术方案。 为在合成过程中除去二聚体杂质，提高依替巴肽的总收率，从而降低生产成本，本发 明提供了一种制备依替巴肽的新型还原-氧化体系，以这种体系进行依替巴肽线性肽的氧 化，可以大大减少甚至完全除去粗品中的二聚体杂质，不仅降低纯化的难度和生产成本，提 高产物总收率，而且该方法操作简便，易于规模化放大生产。
【发明内容】
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 一种制备依替巴肽的新型还原-氧化体系，其特征在于，包括如下步骤： (a) 合成依替巴肽线性粗肽：采用氨基树脂作为固相载体，通过Fmoc固相合成法合成 依替巴肽线性肽肽树脂，然后裂解得依替巴肽线性粗肽。结构式如下： Mpa-HomoArg_GIy-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2 (b) 粗肽中二聚体的还原：将线性粗肽用溶剂溶解后，加入还原剂DTT进行还原反 应，HPLC检测反应终点，得到二聚体含量低于1%的依替巴肽线性肽溶液；其中二硫苏糖 醇（Dithiothreitol,简称为DTT)是一种小分子还原剂，化学式为C4HwO2S2。其还原状态 下为线性分子，被氧化后为包含二硫键的六元环状结构。DTT常被用于蛋白质中二硫键的 还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间的二硫键。文 献Reduction-andthermo-sensitivestarpolypeptidemicellesandhydrogelsfor on-demanddrugdeliveryt介绍了DTT在还原二硫键中的应用。
[0007] (C)依替巴肽线性粗肽的氧化反应：将上述还原反应后溶液用溶剂稀释，用氨水调 节溶液PH至碱性，然后加入氧化剂进行氧化反应，HPLC检测反应终点；反应完全后，用冰乙 酸调节溶液PH至酸性，得依替巴肽粗肽溶液； (d)精肽的制备：依替巴肽粗肽溶液经反相HPLC纯化、脱盐得依替巴肽精肽溶液；浓 缩、冻干后得精肽。
[0008] 在以上方法中步骤（a)的具体操作步骤为：以氨基树脂为固相载体，脱掉Fmoc保 护基后，按照依替巴肽肽序，依次与Fmoc-Cys(Trt)-〇H、Fmoc-Pr〇-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、 Fmoc-Asp (OtBu) -〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-HomoArg (Pbf) -〇H、Mpa (Trt) -OH发生偶联反应， 得到依替巴肽肽树脂；肽树脂经裂解试剂裂解，得到依替巴肽线性粗肽。
[0009] 其中步骤（b)的具体操作步骤为：称取DTT置于反应釜中，加入溶剂溶解，DTT溶 液浓度为20-100mm〇l/L;向DTT溶液中加入依替巴肽线性肽，加入线性肽的浓度为I-100g/ L，搅拌溶解；继续搅拌反应，HPLC监控反应终点。 步骤（c)的具体操作步骤为：还原反应到达终点后，用溶剂稀释线性肽溶液，调节线性 肽浓度为〇. 5g-2.Og/L;用碱调节反应溶液的pH值至7. 0-9. 0 ;在空气中缓慢氧化或加入 少量氧化剂进行加速氧化反应，HPLC监控反应终点。
[0010] 在以上步骤（b)或步骤（C)中，所述溶剂为水、乙腈、甲醇、乙醇、NMP、DMF、丙酮、四 氢呋喃、二氧六环中的一种或几种。
[0011] 步骤（C)中，调节氧化反应溶液的PH值在7. 0-9. 0之间；氧化完全后，调节溶液的 pH值在4. 0-6. 0之间；所述氧化剂为空气，H2O2，DMS0,I2中的一种。
[0012] 优选的，步骤（c)中用氨水调节溶液的pH至7. 0-7.4 ;氧化完全后，用冰乙酸调节 溶液pH至 4. 0-4. 5。
[0013] 相对于现有技术，本发明的有益效果是： 本发明提供了一种制备依替巴肽的新型还原-氧化体系，该技术方案不仅可以大大减 少甚至完全除去粗品中的二聚体杂质，降低纯化难度，使氧化粗肽纯度大于90%，提高收率， 降低生产成本；而且与现有技术相比该方法操作简便，易于大规模生产。
【具体实施方式】
[0014] 下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原 料的投料比、或是反应溶剂及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
[0015] 说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下： Fmoc 9-荷甲氧羰基 OtBu 叔丁氧基Boc 叔丁氧羰基 Pbf 2, 2, 4, 6, 7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基 Trt 三苯甲基 DICN,N-二异丙基碳二亚胺 HOBt 1-羟基苯并三唑 DTT 二硫苏糖醇 DMSO 二甲基亚砜 实施例l:Fmoc_Cys(Trt)-RinkAmideAM树脂的制备 准确称取RinkAmideAM树脂(初始替代度0.97mm〇l/g)600g置于肽树脂合成反应器 中，加入6LDCM溶胀2h。溶胀结束，以DMF洗涤3次，每次5L，然后加入5L20%哌啶/DMF溶 液脱保护两次，分别进行IOmin和lOmin。脱保护完成，树脂以DMF洗涤6次，每次5L。称取 Fmoc-Cys(Trt)-OH852g、H0Bt196g用4LDMF溶解后，加入250mLDIC活化，将溶液加入到反 应器中，反应2h，Kaisertest监测反应进程。反应结束，树脂以DMF洗涤3次，然后加入预 先配制的封端试剂(醋酸酐1L，吡啶850mL，DMF3L)，封端反应40min。封端完成后，DMF洗涤 4次，DCM洗涤2次，甲醇洗涤3次，每次5L，然后真空干燥树脂，共得Fmoc-Cys(Trt)-Rink AmideAM树脂795g。取少量树脂，测定替代度为