一种去除蛋白质中内毒素的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种去除蛋白质中内毒素的方法。
【背景技术】
[0002] 内毒素是革兰氏阴性菌菌体中存在的毒性物质的总称，此类物质由菌体裂解后释 放，又称为"热原"。其化学成分有磷脂多糖-蛋白质复合物，其毒性成分主要为类脂质A。 内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。当细胞溶解、死亡或用人工方法破碎 时，细菌内毒素释放出来。内毒素一般以聚体形式存在，其磷酸基团与二价金属离子螯合可 进一步稳定内毒素分子间的聚合，促成更大的内毒素复合体，这类复合体的分子量可由几 千至数千万不等。
[0003] 内毒素不是蛋白质，因此非常耐热。在100°C的高温下加热1小时也不会被破坏， 只有在160°C的温度下加热2到4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能 破坏它的生物活性。与外毒素不同之处在于：内毒素不能被稀甲醛溶液脱去毒性成为类毒 素。少量内毒素即可引起机体发热，严重的可引起微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内 凝血等。
[0004] 随着生物制品在医药领域中占的比例越来越大，内毒素的去除方法越来越多，工 艺应用也越来越广，内毒素去除工艺将具有更大的经济效益与无穷的市场潜力。由于制品 中的内毒素含量小而危害大，所以要求去除内毒素的方法具有高效、可靠及具有高度特异 性，同时在去除过程中应保持制剂的本身性质及有效成分。目前，去除内毒素的方法主要有 以下几种：
[0005] (1)活性炭吸附法：活性炭吸附法是一种应用较早的去内毒素方法。但活性炭对 各类不同成分的吸附作用研究尚不清楚，在吸附内毒素的同时会吸附部分有效成分。
[0006] (2)化学降解法：化学降解法是以强酸、强碱或氧化物等使内毒素降解的方法。这 种方法有可能造成有效成分的降解或失活，因此，该方法的使用需结合产品的理化性质，蛋 白质等产品不适用。
[0007] (3)层析法：包括离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析等。层析法选择性差，由 于内毒素在高盐溶液中容易形成聚集体，往往需要多种不同的层析方法相结合才能达到去 除内毒素的目的，而这将需要耗费大量时间。
[0008] (4)相分离法：此法操作简单快速，但处理量小，并且中间有低温到高温的温度变 化，这对不稳定的蛋白质极为不利。此外，后续抽提试剂的去除也是一个问题。
[0009] (5)超滤：超滤是以压力差为推动力的膜分离过程，可广泛用于微粒的脱除，其中 包括细菌、病毒、热原和其他异物的去除。
[0010] 随着基因工程制品在生物医药领域所占的比例越来越大，而制品中内毒素含量小 而危害大，去除内毒素的方法也越来越多。大部分的基因工程制品是蛋白类制品，蛋白性质 不稳定、不耐热、易失活，在内毒素去除过程中保证其本身性质及有效活性成分不受影响至 关重要。
【发明内容】
[0011] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种去除蛋白质中内毒素的方法，以 解决现有技术中存在的内毒素去除效率较低的技术问题。
[0012] 本发明解决的另一技术问题是提供一种不影响蛋白质成分和性质的内毒素去除 方法。
[0013] 本发明解决的再一技术问题是提供一种降低蛋白质中内毒素去除工艺的成本。
[0014] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0015] -种去除蛋白质中内毒素的方法，包括以下步骤：
[0016] 1)对待处理样品进行层析纯化，收集目的蛋白；
[0017] 2)取步骤1)得到的目的蛋白利用超滤膜包进行超滤，收集滤过液，其中膜包进口 压力为10~25psi，回流口压力为4~6psi;
[0018] 3)取步骤2)产物用0. 22~0. 45ym孔径的滤膜过滤，收集滤过液。
[0019] 优选的，步骤2)所述膜包中的膜面积与待处理样品总量的比例不低于0.lft2/L。 [0020] 优选的，步骤2)用于超滤的加压栗对每平方英尺膜面积其流量不低于I. 2L/min。
[0021] 优选的，步骤3)收集滤过液后，利用NaOH溶液或H3PO4溶液或NaCLO溶液或 Tergazyme清洗剂或HenkelP3-11清洗膜包；在此基础上进一步优选的，所述NaOH溶液的 浓度为〇? 1~〇? 5mM。
[0022] 优选的，步骤2)所述膜包的截留分子量为100~1000KD。
[0023] 优选的，步骤2)所述膜包的截留分子量为1~100KD。
[0024] 优选的，步骤2)对目的蛋白超滤后，利用缓冲液继续执行超滤3~5min，收集滤过 的缓冲液与超滤后的目的蛋白混合，而后执行步骤3)。
[0025] 优选的，步骤2)所述的超滤为切向流过滤。
[0026] 优选的，步骤1)所述的层析是亲和层析或离子交换层析或疏水层析或凝胶过滤 层析。
[0027] 在以上技术方案中，层析纯化可以根据样品的性质选择相应的填料，可以是特异 性的也可以非特异性的纯化目的蛋白，该步骤一方面可以对蛋白起到纯化作用，同时可以 去除部分内毒素。步骤2)中利用膜包执行超滤，在特定的截留分子量及压力条件下一方面 能够有效去除内毒素，同时还能够对样品蛋白起到浓缩作用，便于后续生产。在执行超滤操 作后，进一步以0. 22~0. 45ym孔径的滤膜执行过滤能进一步去除内毒素，该孔径条件下 对过滤压力要求不大，能够满足规模化处理的工艺要求。
[0028] 在优选技术方案中，限定膜面积与待处理样品比例、限定加压栗流量均是为了在 满足装置耐受能力的条件下确保较快的处理速度，其中单位ft2是平方英尺。在超滤后 增加对膜包的清洗步骤能够显著延长膜包使用寿命，节约成本，所选用的清洗剂中Henkel P3-11是商品名称，具体限定由Henkel公司生产的、型号为P3-11的清洗剂，Tergazyme同 样也是商品名，具体限定由ALC0N0X公司生产的型号为Tergazyme的酶活性清洁剂。限定 截留膜包的两种截留孔径是发现该条件下超滤对蛋白性质无任何影响同时又能够最大程 度的取出内毒素。在对目的蛋白执行超滤后进一步利用缓冲液超滤3~5min并予以收集 是为了尽可能完全的利用，避免蛋白损失。
[0029] 本发明中所述的膜包可以根据不同样品分子量大小、溶剂性质、有效成分性质，判 断和选择膜包的材质、孔径。根据处理样品的多少可以选择不同大小面积的膜，对于每IOL 的处理流体，至少要选用Ift2的膜面积，要保证足够的过滤效率，对于每平方英尺的膜面 积，栗的能力应至少达到I. 2L/min。
[0030] 本发明方法可以在不改变制剂原有性质的条件下，有效地去除蛋白样品中的内毒 素，尤其适用于基因工程菌表达的各类胞内、胞外蛋白，可以用于大规模生物医药制剂的生 产过程中。另一方面，本发明从基因工程疫苗中去除内毒素的方法，首先运用层析法进行预 处理，在纯化了目的蛋白的同时去除了部分内毒素。此外，本发明中运用膜包在去除内毒素 的同时更重要的可以将样品进行浓缩，操作简单、耗时短、便于大规模应用。
[0031] 综合来看，本发明处理量大、处理时间短、操作简便、生产成本低、可将内毒素含量 降低至畜禽临床应用标准范围之内，并且在去除内毒素的同时不影响制品本身的性质，适 合规模化生产应用。
【具体实施方式】
[0032] 以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0033] 以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准 确数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的 范围内变化，比如，"大约1〇〇"表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在"大约第 一数值到第二数值"的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近 似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0034] 除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。
[0035] 实施例I. 1 (重组基因工程菌的诱导表达）
[0036] 按1:100比例接种新鲜菌液至LB液体培养基，培养3_4h，加入IPTG诱导，继续培 养4_5h。6000rpm，离心6min，收集菌体。用1/10菌液体积的PBS洗涤菌体，按100yg/mL 比例加入溶菌酶，30°C水浴30min，于冰上超声破碎菌体。离心，收集上清。
[0037] 实施例1. 2 (蛋白的纯化）
[0038] 介质混匀，装柱；用大约4个柱体积的平衡液（50mMNaH2P04,300mMNaCl，PH8. 0) 平衡介质，直到流出液A280值接近零；取收集的上清液上样，流速约l-2mL/min;用平衡 液清洗介质，直到流出液A280值趋于平衡；用约2个柱体积的洗液（50mMNaH2PO4, 300mM NaCl，PH8.0)清洗Ni2+柱，直到流出液A280值趋于平衡；洗脱液（50mMNaH2PO4,IOmM Tris-Cl，250mM咪唑，8M尿素，PH8.0)洗脱蛋白，收集洗脱液，即为目的蛋白。
[0039] 实施例1. 3 (膜包浓缩）
[0040] 采用截留分子量为300KD和5KD的膜包进行切向流过滤浓缩。首先用去离子水冲 洗回路，控制进液口压力不超过〇.IMPa，出液口压力不超过0. 05MPa。再用缓冲液在系统中 循环3~5min，以减少样品的损失。之后对收集的目的蛋白进行超滤浓缩，直至所需浓缩倍 数。
[0041] 实施例I. 4(滤膜过滤）
[0042] 浓缩后的样品用0. 22um的微孔滤膜过滤，收集滤液，即为目的蛋白。
[0043] 实施例1. 5 (以上方法去除内毒素后，对产物蛋白中内毒素含量的检测）
[0044] 应用鲎试剂凝胶半定量法测定样品中内毒素含量。
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