蛋白质的生产方法

专利名称：蛋白质的生产方法
技术领域：
本发明涉及使用甲醇同化细菌分泌生产蛋白质的方法，所述蛋白质包 括工业上有用的酶或生物活性蛋白。
背景技术：
曱醇是能够以低成本大量获得的发酵原料，并且其作为碳源是非常有
用的。已经开发出使用曱醇'为主要碳源，用甲醇同化细菌生产L-氨基酸的 方法(专利文献l)和使用曱醇同化细菌生产多糖的方法(专利文献2)。
同样，到目前为止已知在毕赤酵母属酵母(户/c/z/ayeast)中使用醇氧化酶 (AOX)基因的启动子通过甲醇诱导在菌体内生产IacZ的例子(非专利文献1) 和使抑肽酶(牛源、胰腺胰蛋白酶抑制剂)以活性型分泌到培养物上清液中的
此外，在甲醇同化细菌中，已知有在非专性甲醇同化细菌扭脱曱基杆 菌(Mef/zy/okzc&n'wm exfo^ww)的细胞内蓄积荧光蛋白(GFP)的例子(专利文 献3、非专利文献3),但尚未得知在专性曱醇同化细菌中向菌体外分泌蛋白 的例子。
专利文献1:欧洲专利公开第1188822号说明书 专利文献2:特开平11-56384号公报 专利文献3: WO2003/046226 Al
非专利文献1: Nucleic Acids Res. 1987 May 11;15(9):3859-76. 非专利文献2: J Ind Microbiol. 1991 Apr;7(3):197-201. 非专利文献3: FEMS Microbiol Lett 2000 Dec 15; 193(2): 195-200

发明内容
本发明的课题是提供有效分泌生产目前难于用埃希氏菌属(&c/犯nc/7/a) 本发明人等注意到源自甲醇同化细菌的启动子、信号序列，并进行了深入的研究。结果发现通过将携带DNA构建体的曱醇同化细菌培养在以甲 醇为主要碳源的培养基中，所述DNA构建体包含可在曱醇同化细菌中发挥 作用的启动子序列以及编码信号序列和目的蛋白的核酸序列，能够有效地 分泌生产蛋白质，从而完成了本发明。 即本发明如下。
(1) 蛋白质的生产方法，该方法包括通过在以曱醇为主要碳源的液体培 养基中培养携带DNA构建体的曱醇同化细菌，使该细菌分泌目的蛋白，其 中所述DNA构建体包含在曱醇同化细菌中发挥功能的启动子序列和以可表 达的形式连接于该启动子序列的、编码包含信号序列和所述目的蛋白序列 的多肽的核酸序列；和回收分泌的目的蛋白。
(2) 根据(1)的方法，其中所述在曱醇同化细菌中发挥功能的启动子序列 选自曱醇脱氢酶启动子、tac启动子、cjE启动子和核糖体蛋白启动子。
(3) 根据(1)的方法，其中所述启动子序列为具有序列号11、 12、 21或 22的》咸基序列的启动子。
(勺根据(1卜(3)任一项的方法，其中所述信号序列为选自甲醇脱氬酶、 肌醇六磷酸酶和酸性磷酸酶的蛋白质的信号序列。
(5) 根据(1卜(3)任一项的方法，其中所述信号序列具有选自序列号18和 20的氨基酸序列。
(6) 根据(1 ) (5)任一 项的方法，其中所述曱醇同化细菌为选自下组的细 菌嗜曱基菌属(AfeAj;/op/n7MS)细菌、曱基菌属(A/W/^/oZ^cz7/w力细菌、噬曱 基菌属0W"/^/o/ /zaga)纟田菌、无色杆菌属(Jc/7rawo6acfe。纟田菌、，l单月包菌属 (尸seMfifowo"aw)细菌、精朊杆菌属(尸ratom/w6acfe。细菌、曱坑单胞菌属 (M""/^〃omowa力纟田菌、农i环菌属(A^'crac少c/w力纟田菌和甲基4干菌属 (脸 /0ZwCe〃-纖)纟田菌。
(7) 才艮据(1) (6)任一项的方法，其中所述蛋白为选自肌醇六磷酸酶、白 细胞介素、转谷氨酰胺酶、千扰素、胰岛素、酸性磷酸酶和肽合成酶(peptide synthase)的蛋白。
(8) 根据(1) (7)任一项的方法，其中所述甲醇同化细菌为专性甲醇同化
纟田菌。
(9)根据(8)的方法，其中所述专性甲醇同化细菌为选自下组的细菌嗜 曱基菌属CM"/z_y/opfe7"》细菌、曱基菌属(A/"/^/o^"'〃m力细菌和噬曱基菌属
(她~/。/7/^")纟田菌。 发明的优选实施方式
本发明的生产方法的特征在于通过在以曱醇为碳源的液体培养基中 培养携带DNA构建体的曱醇同化细菌，使该细菌分泌目的蛋白，其中所述 DNA构建体包含在曱醇同化细菌中发挥功能的启动子序列以及以可表达的 形式连接于该启动子序列的、编码包括信号序列和目的蛋白序列的多肽的 核酸序列；和回收分泌的目的蛋白。在本文中术语"分泌'，指将目的蛋白 由细胞内排出(excretion)或释放(release)到菌体外，不包括目的蛋白在细胞内 的蓄积。
即通过该甲醇同化细菌，首先产生包含信号序列和目的蛋白的多肽， 然后通过切断信号序列将目的蛋白转移至周质，其后目的蛋白被分泌至菌 体外。回收这些分泌的蛋白即可进行目的蛋白的生产。以下，将使细菌分 泌蛋白、并回收该蛋白的生产过程成为"蛋白的分泌生产"。
已知通常将分泌性蛋白翻译成前肽(prepeptide)或前肽原 (prepr叩eptide)，之后它们成为成熟蛋白。即，众所周知在将分泌性蛋白翻 译为前肽或前肽原后，通过切割前体部分(pre-portion)转变为成熟肽或肽原 (propeptide),肽原在蛋白酶的作用下其原体部分(pro-portion)进一步被切割， 从而成为成熟蛋白。担负着这样的信号肽切割任务的蛋白酶通常被称为"信 号肽酶"。
在本发明中，目的蛋白可以是以成熟蛋白或肽原的形式分泌的蛋白， 当其以肽原的形式分泌时，在回收后用适当的蛋白酶进行处理，可以获得 成熟蛋白。
在本说明书中，术语"信号序列"是指存在于分泌性蛋白前体的N-末 端的、在蛋白分泌时被识别的序列；而术语"信号肽"是指由这些氨基酸 残基构成的肽。
在本发明中，同时具有前体序歹'j(pre-sequence)和原体部分(pro-portion) 的蛋白，即初级翻译产物(primary translation product),可以称为"前蛋白质 原(preproprotein)"; 而具有原体部分4旦;殳有前体部分的蛋白可以称为"蛋白
质原(proprotein)"。蛋白质原的原体部分可以称为"原体结构部分 (pro-structural portion)"或简称"原体结构(pro-structure)";而在本i兌明书中， 蛋白质的"原体结构部分/原体结构"和蛋白质的"原体部分"可以互换使 用。
本发明的生产方法中使用的细菌可以通过将DNA构建体导入甲醇同化 细菌而获得，其中所述DNA构建体包含在曱醇同化细菌中发挥功能的启动 子序列和以可表达的形式连接于该启动子序列的、编码包括信号序列和目 的蛋白序列的多肽的核酸序列。
这里，术语"甲醇同化细菌"指能够以甲醇为主要碳源进行生长的细
菌，包括属于嗜曱基菌属(似^/^/0/ /7//^)、甲基菌属(M"/z少/W""7/w力、噬曱 基菌属、 无色卄干菌属(爿c/ ramo6(3Cfer)、，支单刀包菌属 CP化z^omo"a力(特开昭45-25273号公报)、精朊杆菌属OPrato腦'"o/^"er)(特 公昭49-125590号公报)、曱烷单胞菌属(《ef/7awomo7^M)(特开昭50-25790 号公报)、微环菌属(M/craqyc/w力(特开昭52-18886号公报)和曱基杆菌属 (Me^y/o6acfen'wm)等的细菌。其中，优选专性甲醇同化细菌，其在以葡萄 糖为唯一碳源的条件下不能生长或仅微弱生长。具体地，可以以曱醇为主 要碳源进行生长而在以葡萄糖为唯一碳源的条件下不能生长或仅微弱生长 的细菌例如有嗜曱基菌属细菌、甲基菌属细菌和噬曱基菌属细菌。其中包 括嗜甲基菌属细菌例如食曱基嗜甲基菌(Mef/^/o; /u7Ms me^y/ofrop/zws);甲 基菌属细菌例如糖原曱基菌(Me / 少/oZ)ac/〃z^ g/少coge"e力、鞭毛曱基菌 (M^/^/o6acz'〃w /Zage〃Ww); 嗟曱基菌属细菌例如深海噬曱基菌 (A/e/Ay/op/Mga //za/(2M/c")、海p藍甲基菌(7We^y/op/wga wan'"fl)、嗜i咸谨曱基 菌(Me /op/zaga a/ca/一//(3) (Biology of Methylotrophs; Edited by Israel Goldberg and J. Stefan Roken and published by Butterworth-Heinemann)。 jt匕夕卜, 还优选具有向菌体外分泌甲醇脱氢酶(MDH)机能的细菌。
食曱基嗜曱基菌例如有AS1菌抹(NCIMB 10515)、W3A1 (NCIMB 11348 菌林)、ATCC 53528菌抹等。食甲基嗜曱基菌AS1菌株(NCIMB 10515)和 W3A1 (NCIMB 1l348菌抹)可以从国立工业、食品和海洋细菌保藏中心(地 址NCIMB Lts., Tony Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom)获得。 糖原曱基菌例如有T-ll菌抹(NCIMB 11375)、 ATCC 21276菌抹、ATCC 21371菌抹、ATCC 29475菌林、ATR80菌抹(见Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)， vol. 42, p67-72)和A513菌抹(见Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994), vol. 42， p67-72)。糖原曱基菌NCIMB 11375菌抹可以从国立工业、食品和海 洋细菌保藏中心(地址NCIMB Lts., Tony Research Station 135， Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom)获得。
鞭毛曱基菌例如有ATCC 51484菌抹、KT菌抹(见N. I. Govorukhina等， Microbiology (Russia) 56 (1987), pp. 849-854)、 VKM B-1610菌株等。鞭毛曱 基菌VKM B-1610菌抹可以从全俄罗斯微生物保藏中心(ALL-RUSSIAN COLLECTION OF MICROORGANISMS) (Russia, 142290, Moscow Region, Pushchino, pr. Nauld, 5, IBPM)获得。
食曱基嗜甲基菌ATCC 53528菌抹，糖原曱基菌ATCC 21276菌抹、 ATCC 21371菌抹、ATCC 29475菌株和鞭毛曱基菌ATCC 51484菌抹可以从 美国典型培养物保藏中心(ATCC,地址P. O. Box 1549, Manassas, VA20108, 1, United States of America)获得。
深海噬曱基菌例如有ATCC 33145菌抹、ATCC 33146菌抹等。海噬曱 基菌例如有ATCC 35842株等。嗜石咸噬曱基菌例如有ATCCBAA-297TM等。 深海噬曱基菌ATCC 33145菌抹、ATCC 33146菌株可以从美国典型培养物 保藏中心(ATCC，地址P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America)获得。
上述导入曱醇同化细菌的DNA构建体所包含的"在曱醇同化细菌中发 挥功能的启动子"是指在上述曱醇同化细菌中具有启动子活性的启动子， 但不限于源自曱醇同化细菌的启动子，也可以是源自其它微生物的启动子。 此外，"在曱醇同化细菌中发挥功能的启动子"既包括曱醇诱导型启动子， 也包括非诱导型启动子。曱醇诱导型启动子例如有曱醇脱氢酶基因的启动 子、二羟基丙酮合酶基因的启动子和甲酸脱氢酶基因的启动子等。
在曱醇同化细菌中发挥功能的启动子具体包括但不限于可曱醇诱导的 曱醇脱氢酶基因的启动子(序列号11)、源自大肠杆菌的高表达启动子tac启 动子(序列号12)、 ciE启动子(序列号21)和核糖体蛋白启动子(序列号22)。
此外，启动子序列不限于野生型启动子，并且可以是修饰野生型的序 列以高表达目的基因而获得的启动子。例如，可以是在上述野生型启动子
序列中发生几个碱基的取代、缺失、添加或插入的序列，只要其在上述细
菌中具有启动子活性。此外，为了增加启动子活性，可以在-35区或-10区 对启动子进4亍修饰，也可以调节-35区和-10区之间的间隔区(spacer region) 的长度来对启动子进行修饰。这种修饰-35区和-10区的方法例如有EP 1,033,407中记载的方法和Nucleic Acids Res. 1999 Dec 15; 27(24): 4768-74中
记载的方法等。
启动子的活性可以由RNA合成起始的频率进行定义。Goldstein等的论 文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.， 1995, 1,
105-128)等中记载了启动子活性的评价方法和能够用于本发明的强启动子 的实例。此外，如WO 00/18935中所公开，在目的基因的启动子区引入几 个碱基的碱基取代，可以将其修饰为更强的启动子。
在导入曱醇同化细菌的DNA构建体中，在上述启动子的下游以可表达 的形式连接有编码包含信号序列和目的蛋白的多肽的核酸序列。
"在曱醇同化细菌中发挥功能的信号序列"是指下述序列当其连接 于目的蛋白时，所述曱醇同化细菌能够识别该信号序列并分泌目的蛋白。
信号序列可以是来自与目的蛋白不同的蛋白的信号序列，也可以是目 的蛋白的前体蛋白所包含的信号序列。然而，信号序列优选来自于所使用 的宿主甲醇同化细菌的分泌性蛋白。此外，用于本发明的目的的信号序列 可以包含一部分目的蛋白的N末端侧的氨基酸序列，所述目的蛋白在该信 号序列的起源前体蛋白中与该信号序列相连。
当信号序列与目的蛋白的起源不同时，可以将前蛋白原称为"异源融 合前蛋白原(heterologous fusion preproprotein)"。 例j口, 当蛋白为月夷岛素时, 与"前胰岛素原(preproinsulin)"或"胰岛素原(proinsulin)"相对应，可以称 为"异源、禹虫合前月爽岛素y^、(heterologous fusion preproinsulin)"。
对于信号肽，只要其可以在曱醇同化细菌中发挥功能，没有特别的限 制，可以使用源自曱醇同化细菌分泌蛋白的信号序列，也可以使用源自其 它细菌、酵母、植物或动物等分泌蛋白的信号序列。比较具体地，例如源 自食曱基嗜甲基菌的甲醇脱氢酶(MDH)的信号序列(序列号18的氨基酸序 列)。此外，源自其它细菌的信号序列例如有由大肠杆菌的appA基因编码 的肌醇六磷酸酶的信号序列(序列号20的氨基酸序列)、摩氏摩根氏菌(71^/^朋￡//^附0^朋")的酸性磷酸酶的信号序歹|](序列号26的位置1 20)等。 编码这些氨基酸序列的碱基序列分别示于序列号17、 19和25。
编码信号序列的碱基序列可以是编码野生型信号序列的碱基序列，也 可以是发生了取代的编码野生型信号序列的碱基序列，所述取代使其密码 子适合在分泌生产蛋白的曱醇同化细菌中使用。
对于可根据本发明的方法进行分泌、回收的"目的蛋白，，没有特别限 制，只要其通过与在上述曱醇同化细菌中发挥功能的信号序列连接从而可 以用甲醇同化细菌进行分泌，所述"目的蛋白"包括各种蛋白，例如源自 动植物、微生物的分泌性蛋白和胞内蛋白。本发明的方法同样适用于目前 为止无法用埃希氏菌属(Esc/zen'c/z/a)细菌等革兰氏阴性细菌进行分泌生产的 蛋白。此外，"目的蛋白"优选与宿主曱醇同化细菌起源不同的异源蛋白。
当使用分泌蛋白作为"目的蛋白"时，可以使用具有已将前体序列和 原体序列从前体中除去的序列的蛋白，也可以使用包含原体序列的蛋白。 然而，"目的蛋白"是由前体蛋白通过切断肽键而除去了构成前体部分和原 体部分的至少一个氨基酸的蛋白即可，包括N末端区与天然成熟蛋白的N 末端区完全一致的蛋白、与天然成熟蛋白相比在N末端残留有来自前体部 分或原体部分的至少一个氨基酸的蛋白以及氨基酸序列短于天然成熟蛋白 的蛋白。
对于适用本发明的生产方法的目的蛋白没有特别的限制，例如有下列 蛋白的成熟蛋白或蛋白原。 肌醇六磷酸酶(phytase) (EC3丄3.2 3.1.3.26)
人白细胞介素2 (IL2: Genbank登录号(Accession No.) AAK26665等，成熟型
为21~153位的氨基酸序列)
蛋白谷氨酰胺酶(protein glutaminase)
转谷氨酰胺酶(Genbank Accession No. AF531437等)
干扰素
胰岛素(特开平O7-284394等)
酸性磷酸酶
肽合成酶(WO 2004/011653 、 WO 2004/065610) 粒细胞刺激因子(GCSF)
这其中优选的是在后述的实施例中生产的肌醇六磷酸酶和酸性磷酸酶。
月几醇六石舞酸酶(又称磷酸酐磷酸化酶(phosphoanhydride phosphorylase)) 是水解肌醇六磷酸4丐镁(phytin)(又称肌醇六磷酸(inositol hexakisphosphate)、 肌醇六磷酸(phytic acid))的酶，其在食品领域、农业领域和医药领域十分有 价值。可以利用以下的肌醇六磷酸酶。关于各种肌醇六磷酸酶的氨基酸序 列及编码它们的碱基序列的信息，可以参照其Genbank Accession No.获取。 源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶Genbank Accession No. AAC74065 (序列号 16)成熟蛋白为23 432位的氨基酸序列
源自霉菌的肌醇六磷酸酶GenbankAccessionNo. AAU93518、 AAU93517、 AAG40885、 BAB40715
源自芽孢杆菌属(5flc"/w力的月几醇六磷酸酶Genbank Accession No. AAC38573、 AAG17卯3、 AAL59320
源自酵母菌的肌醇六石粦酸酶Genbank Accession No. CAB70441
源自耶尔森氏菌属(肠油)的肌醇六磷酸酶:Genbank Accession No.
YP—070934
源自克雷伯氏菌属(尺/eZwW/a)的肌醇六磷酸酶Genbank Accession No. AAM23271
源自黄单月包菌属(A^"^o"w"as)的月几醇六石奔酸酶Genbank Accession No. AAM38967
源自假单胞菌属的肌醇六磷酸酶Genbank Accession No. AAN77879 源自蘑菇的肌醇六磷酸酶Genbank Accession No. CAC48195、 CAC48164、 CAC48234
源自玉米的月几醇六磷酸酶Genbank Accession No. AAB52233
Genbank Accession No. AAK49438 Genbank Accession No. AAF60315 Genbank Accession No. AAA42305 酸性磷酸酶是催化酸性条件下磷酸酯水解的酶(EC3.1.3.2),可以使用例 如以下源自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶、WO 96/37603中记载的酸性磷酸酶
源自大豆的肌醇六磷酸酶 源自甘薯的肌醇六磷酸酶 源自大鼠的肌醇六磷酸酶
源自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶Genbank Accession No. AB035805
25)，成熟蛋白为21 259位的氨基酸序列
根据所使用的宿主和/或为了获得所需的活性，可以对编码这些蛋白的 基因进行修饰，这其中包括使其编码的氨基酸序列发生至少一个氨基酸的 添加、缺失或取代等的修饰。包括修饰技术、基因克隆技术、产生的蛋白 的检测技术在内的 一般分子生物学方法均是本领域技术人员公知的，可以 参考例^口 Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N Clover ed. 1985); FM. Ausubel et al. (eds)， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich， ed., Stockton Press等。当生产异源蛋白时， 可以使用经如下修饰的基因将基因中的密码子替换为在进行分泌表达的 微生物中使用频率高的密码子。
使用基于已知序列设计的引物进行PCR等，可以获得编码蛋白的基因。 此外，还可以采用基于同源性等从微生物、动植物等的染色体中通过杂交 等方法分离编码目的蛋白的基因，并且测定其碱基序列的基因等。此外， 还可以使用根据已知碱基序列化学合成的基因。序列信息可以从Genbank 等数据库获得。
此外，目的蛋白可以是在一个或多个位置上具有一个或几个氨基酸的 取代、缺失、插入或添加的蛋白，只要其具有目的蛋白的活性。在本发明 中，因氨基酸残基在蛋白的立体结构中的位置或其类型而异，"一个或几 个"具体为1至30个，优选1至20个，更优选1至10个。
上述的蛋白质的取代是保持蛋白质活性的保守取代。取代是指去除氨 基酸序列中的至少1个残基，并且在该位置上插入其它残基的改变。取代 酶蛋白的原有氨基酸并被认为是保守取代的氨基酸的例子包括用Ser或 Thr取代Ala;用Gln、 His或Lys取代Arg;用Glu、 Gln、 Lys、 His或Asp 取代Asn;用Asn、 Glu或Gin取代Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、 Glu、 Lys、 His、 Asp或Arg取代Gin;用Gly、 Asn、 Gln、 Lys或Asp耳又代 Glu;用Pro取代Gly;用Asn、 Lys、 Gln、 Arg或Tyr取代His;用Leu、 Met、 Val或Phe取代lie;用Ile、 Met、 Val或Phe取代Leu;用Asn、 Glu、 Gln、 His或Arg取代Lys;用Ile、 Leu、 Val或Phe.耳又代Met;用Trp、 Tyr、
Met、 lie或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;用Ser或Ala取代Thr; 用Phe或Tyr取代Tip;用His、 Phe或Trp取代Tyr;和Met、 lie或Leu取 代Val。
编码与上述蛋白基本上相同的蛋白的DNA可以通过对编码这些酶的 碱基序列进行修饰而获得，例如采用位点特异突变方法将特定位置的氨基 酸残基取代、缺失、插入、添加或倒置(inverted)。此外，上述修饰的DNA 也可以通过常规公知的突变处理获得。突变处理包括例如在体外用羟胺 等处理未突变的DNA的方法；通过紫外线照射或使用常规突变处理用诱变 剂来处理包含未突变的DNA的微生物例如埃希氏菌属细菌的方法，所述常 规诱变处理用诱变剂如N-曱基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝酸等；将 PCR反应溶液中的脱氧核苷酸的组成比例例如由通常的相等比例改变为不 等比例从而人为地引发随机错误的方法，即易错PCR法等。
在适当的细胞中表达具有这种突变的DNA并且考察表达产物的活性， 可以获得编码基本上相同的蛋白的DNA。
同样，从编码突变蛋白的DNA或包含该DNA的细胞中可以获得下述 DNA，所述DNA在严紧条件下与例如野生型基因碱基序列的互补序列或具 有该序列的一部分的探针杂交，并且所述DNA编码具有目的蛋白的活性的 蛋白。在本文中术语"严紧条件"是指形成所谓的特异性杂交但不形成非 特异性杂交的条件。将该条件明确地数值化是困难的，可以示例性地举出 下列条件同源性高的DNA之间例如具有70%以上、优选80%以上、更优
上述值低的DNA之间不发生杂交的条件；或者在与常规Southern杂交的洗 涤条件即60°C 、 lx SSC、 0.1% SDS(优选0.1 x SSC、 0.1% SDS)相当的盐浓
度下杂交的条件。
如上所述的目的蛋白可以直接与信号序列相连，也可以通过接头序列 间接与信号序列相连。当包含接头序列时，这样的接头序列可以使用任意
序列，只要其不抑制多肽的生产性能和目的蛋白的活性，例如，可以使用 多聚组氨酸等用于纯化目的蛋白的序列等。
通过使用限制酶等连接编码信号序列的核酸序列和编码目的蛋白的核 酸序列等方法，可以适宜地制备编码包含信号序列和目的蛋白的多肽的核
酸序列。
此外，当使用的信号序列和目的蛋白源自相同的前体蛋白时，可以采
用PCR等扩增编码包含信号序列和目的蛋白的前体蛋白的序列以备使用。 作为PCR方法，可以使用各种公知的改进方法，这其中采用交换PCR法 (crossover PCR)有利于扩增。
通过将编码含信号序列和目的蛋白的多肽的核酸序列以可表达的形式 连接于启动子，可以制备导入甲醇同化细菌的DNA构建体。"将编码含信 号序列和目的蛋白的多肽的核酸序列以可表达的形式连接于启动子"是指 将该构建体导入细菌时，编码多肽的mRNA由启动子转录，从而使得该细 菌产生该多肽。
所述核酸序列优选以下述形式连接于启动子在多肽编码序列的起始 密码子之前连接，从而使其含有包括转录起始位点在内的5'-非翻译区。5，-非翻译区可以使用启动子的来源序列的5，-非翻译区，例如使用MDH基因 启动子时可以使用MDH基因的5，-非翻译区。此外，5'-非翻译区可以使用 信号序列编码序列的来源基因的5，-非翻译区，例如使用肌醇六磷酸酶的信 号序列时可以使用肌醇六磷酸酶基因的5，-非翻译区。
此外，在使用5，-非翻译区时，可以使用经如下修饰的5，-非翻译区对 核糖体结合位点CRBS;)与起始密码子之间的间隔区、特别是起始密码子邻近 上游的序列中的数个核苷酸进行取代，因为已知上述修饰对mRNA翻译效 率的影响显著。
此外，为获得如上所述的DNA构建体而进行的操作可以使用易于基因 重组的埃希氏菌等革兰氏阴性细菌，也可以直接使用分泌蛋白的微生物进 行。
为了对曱醇同化细菌进行修饰以使其包含上述DNA构建体，例如可以 导入携带上述DNA构建体的载体。例如，可以将编码所述蛋白的基因片段 与在甲醇同化细菌中发挥功能的载体优选多拷贝型载体相连，制备重组 DNA,然后导入该重组DNA来转化曱醇同化细菌宿主。
目的启动子、信号序列和蛋白序列，可以例如采用以含有目标序列的 动物、植物、微生物的染色体DNA为模板的PCR方法(参见PCR:聚合酶 链式反应；White，T丄et al., Trends Genet" 5, 185(1989))获得。染色体DNA, 可以例如根据Saito和Miura的方法(参见H. Saito and K,Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963);生物工学实验书、日本生物工学会编、97 ~
98页、培风馆、1992年)等，从作为DNA供体的细菌制备。用于PCR的引 物，可以基于在Genbank等公共数据库登录的基因序列进行制备，或者可 以基于其它的细菌等中序列在已知的基因间保守的区域的信息进行制备。
能够在曱醇同化细菌中自主复制的载体例如可在嗜曱基菌属 (Me^y/o; /H7w》细菌、曱基菌属(M^/^/o6a"'〃0细菌中自主复制的质粒。具 体而言有广宿主范围载体RSF1010及其衍生物等，例如pAYC32 (Chistosterdov， A. Y., Tsygankov, Y. D. Plasmid, 1986， 16， 161-167)、 pMFY42 (gene, 44, 53 (1990》、pRP301或pTB70 (Nature, 287, 396, (1980))等。
同样，在本说明书的实施例中4吏用的pAYCTER3是优选的载体。 pAYCTER3是在pAYC32的基础上删除了其链霉素抗性基因(strA,B)的上游 区域，并且在该位置插入了 pUC19的多克隆位点和大肠杆菌rrnB基因的终 止子而获得的质粒。即，pAYCTER3是一种高表达载体，其本身不表达链 霉素抗性，但如果在多克隆位点沿strA的正向插入包含启动子序列的DNA， 则可通过连读变为链霉素抗性。
为了将上述DNA构建体与携带在甲醇同化细菌中发挥功能的标记的载 体相连接从而制备重组DNA,可以用适合于目的基因的末端的限制酶切割 该载体。连接通常使用T4DNA连接酶等连接酶进行。
可以按照至今为止报导的转化方法将如上述制备的重组DNA导入曱醇 同化细菌。例如由处于增殖阶段的细胞制备感受态细胞并且将DNA导入 其中的方法(Dubunau and Davidoff-Abelson, J. Mol. Biol" 56， 209 (1971); Duncan, C. H.， Wilson, G. A. and Young， F.E.， Gene, 1， 153 (1977)),或者将宿 主细胞转化成易于吸纳重组DNA的原生质体或原生质球状态从而将重组 DNA导入DNA受体细菌的方法(Chang, S. and Choen, S.N.， Molec. Gen. Genet., 168， 111 (1979》。
此外，可以使曱醇同化细菌的染色体DNA上存在单拷贝或多拷贝的本 发明的DNA构建体，实现构建含有本发明的DNA构建体的甲醇同化细菌 的目的。可以采用下述方法在曱醇同化细菌的染色体DNA上以单拷贝或多 拷贝的形式导入本发明的DNA构建体利用在染色体DNA上存在多个拷 贝的序列作为靶标的同源重组，或者使用噬菌体等进行的在染色体DNA上 的随机插入。关于在染色体DNA上存在多个拷贝的序列，可以利用转座子、 重复序列和存在于转座因子末端的反向重复序列等。此外，载体的扩增和
染色体上的多拷贝化可以与上述表达调控序列的修饰进行组合。
在以曱醇为碳源的液体培养基中培养如上述获得的甲醇同化细菌，使
该细菌分泌所述目的蛋白并回收分泌的目的蛋白，可以进行蛋白的生产。
在本说明书中，"分泌"蛋白质或肽是指将蛋白质或肽分子转运至细
菌菌体外(细胞外)，其不仅包括蛋白质或肽最终在培养基中处于完全游离状
态的情况，还包括蛋白质或肽仅部分存在于菌体外的情况，以及蛋白质或
肽存在于菌体表层的情况。
本发明中优选的分泌程度是可以从培养基或菌体回收目的蛋白。
将甲醇同化细菌培养在以甲醇为碳源的培养基中。以曱醇为碳源的培
养基例如有添加了 0.001 30%曱醇的培养基。所述培养基还可以含有曱醇以
外的碳源，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等糖类， 甘油、山梨糖醇等醇类，延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。
作为除曱醇以外的其它培养基成分，可以添加在通常的培养中使用的 氮源、无机离子等培养基成分。为了获得较高的生长，视需要还可以添加 维生素、氨基酸等有机微量营养元素。作为氮源，可以使用氨气、氨水、 铵盐或其它。作为无机离子，可以视需要适宜地使用钙离子、镁离子、磷
酸根离子、钾离子、铁离子等。培养例如可以在pH 5.0 9.0、 15。C 45。C的 适合范围内，在需氧条件下进行，培养时间可以是约1 7天。在这样的条 件下培养曱醇同化细菌，可以在菌体内大量产生并有效分泌目的蛋白。
当使用MDH基因启动子等可甲醇诱导的启动子时，可以在诱导条件下 进行培养，以提高多肽的产量。可以采用通常用于诱导MDH基因启动子等 的条件进行诱导。通常，在曱醇中培养曱醇同化细菌时，无需特别诱导， MDH启动子即可发挥功能。
根据本领域技术人员公知的方法，可以从培养后的培养基中分离、纯
化本发明的分泌到培养基中的蛋白。例如，在通过离心分离等除去菌体后， 采用适合的已知方法例如盐析、乙醇沉淀、超滤、凝胶过滤层析、离子交 换柱层析、亲和层析、中高压液相层析、反相层析或疏水层析或它们的组 合，可以进行蛋白的分离和纯化。而且，当多肽包含纯化用序列时，可以 利用该序列进行纯化。
在通过本领域技术人员公知的方法例如提高盐浓度或使用表面活性剂 来溶解蛋白质之后，按照与分泌到培养基中的情况相同的方式，也可以分
离和纯化本发明的分泌到菌体表层的蛋白。此外，在某些情况下也可以不 进行溶解处理而使用分泌到菌体表层的蛋白，例如将其作为固定化酶。
以下通过实施例对本发明进行更详细的说明，但这些实施例并不在任 何意义上构成对本发明的限制。
实施例
实施例1:源自大肠杆菌K-12菌林的p-内酰胺酶在食曱基嗜甲基菌ATCC 53528中的分泌表达
(1 )在曱基同化细菌中发挥功能的表达质粒pAYCTER3的构建
采用本领域技术人员公知的方法对序列号3和序列号4记载的合成 DNA进行退火，以制备多位点接头(polylinker),所述序列号3和序列号4 记载的合成DNA被设计成含有pUC19的多克隆位点的序列。该多位点接 头被设计成具有与用限制酶EcoRI和BglII切割后相同的末端形式。然后， 合成序列号5和序列号6记载的引物，采用PCR方法，从按常规方法(Saito 和Miura的方法，[Biochem, Biophys. Acta， 72, 619 (1963)])制备的大肠杆菌 K-12菌抹的染色体DNA中扩增出编码miB的终止序列的区域。在序列号 3的引物中设计由限制酶BglII识别的序列，并且在序列号4的引物中设计 由限制酶Bcll识别的序列。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARABIO INC. 制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。用限制酶BglII和 BclI消化该PCR片段，然后将其与前述多位点接头连接，得到约400 bp的 DNA片段。使用DNA Ligation Kit Ver. 2.1(由TAKARA BIO INC.制造)进行 连接反应，反应条件采用制造商建议的方案。接下来，用限制酶EcoRI和 BamHI切割公知的质粒pAYC32 (丄Gen. Microbiol., 137, 169-178 (1991)),回 收切出的约9.2 kbp的片段，通过将前述的DNA片段插入其中，构建在食 曱基嗜曱基菌ATCC 53528中发挥功能的表达质粒pAYCTER3 。该 pAYCTER3的结构缺失pAYC32中的strA基因的5'侧上游序列，取而代之 的是pUC19多克隆位点和rmB终止子，并且包含源自大肠杆菌的(3-内酰胺 酶基因。
(2) p-内酰胺酶在食甲基嗜甲基菌ATCC 53528中的分泌表达
用在上述(l)中构建的用pAYCTER3转化的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528，选择在含25 mg/1氨苄西林和1%甲醇的SEIIA琼脂培养基(硫酸铵5g、 K2HP041.9g、 NaH2P04.2H20 1.56g、硫酸镁200 mg、氯化钙72mg、硫 酸铜5 ng、碌u酸锰25 jig、石危酸锌23 )ig、三氯化4失9.7 mg、琼脂15 g，溶 flLH20,调至pH 7.0)上生长的菌抹。接下来，用含25 mg/l氨千西林和 2%曱醇的SEIIA液体培养基培养选出的携带pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌 ATCC 53528，培养条件为37°C、 48小时。培养结束后，对携带pAYCTER3 的食曱基嗜甲基菌ATCC 53528的菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE，可 以检测出培养物上清液中含有与(3-内酰胺酶同分子量的蛋白。使用蛋白测 序仪PPSQ-21A(由岛津制作所制造)测定该蛋白的N末端序列，结果确定其 为(3-内酰胺酶的成熟序列，从而确认了 (3-内酰胺酶分泌至培养物上清液中 的事实。
实施例2:源自大肠杆菌K-12菌林的肌醇六磷酸酶在食甲基嗜甲基菌 ATCC 53528中的分泌表达
(l)源自食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脱氢酶基因的获取
源自食甲基嗜曱基菌W3A1菌抹的曱醇脱氢酶基因的序列既已测定 (Genbank Accession No. U41040)。参考该序列，合成序列号1和序列号2所 示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备的食曱基 嗜曱基菌ATCC 53528的染色体DNA中扩增出编码甲醇脱氢酶序列的区域。 使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC制造)进行PCR反应，反应 条件采用制造商建议的方案。
然后，将扩增出的约l.Okb的DNA片段使用Random Primer DNA Labeling Kit Ver 2.(由TAKARA BIO INC.制造)和[a-32P]dCTP按试剂盒附带 的说明书进行反应，由此制备DNA探针。使用制备的探针和食曱基嗜曱基 菌ATCC 53528的染色体DNA，按照如分子克隆第二版(Molecular Cloning 2nd edition) (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press， p9.31 (1989))中描述的常规方法进行Southern印迹杂交，确 认了在用限制酶PvuII切出的约5.5 kb的片段中存在曱醇脱氢酶基因。因此， 使用EASYTRAPVer.2(由TAKARA BIO INC.制造)，通过琼脂糖凝胶电泳回 收用限制酶PvuII消化食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的染色体DNA所得的 约5.5 kb的片段，将该片段插入pUC18 (由TAKARA BIO INC制造)的Smal 位点，然后将所得质粒导入大肠杆菌JM109 (由TAKARA BIO INC.制造)的 感受态细胞中，由此制备文库。
使用之前制备的曱醇脱氢酶的DNA探针，采用分子克隆第二版(J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl.91 (1989))的菌落杂交方法进行文库筛选，获取携带克隆了曱醇脱氢酶基 因片段的质粒的菌抹，从该菌抹回收质粒，将其命名为pUMDH。测定克隆 于pUMDH的片段的碱基序列，确认了食曱基嗜甲基菌ATCC 53528的曱醇 脱氢酶基因具有显示与食曱基嗜曱基菌W3A1菌抹的曱醇脱氢酶基因95% 以上同源性的碱基序歹'j(序列号13)。碱基序列测定结果表明约5.5 kb的 PvuII片段包含全长曱醇脱氢酶基因及其5，侧上游约2.5 kb。碱基序列的测 定使用染料终止循环测序试剂盒(terminator cycle sequencing kit;由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序4义373A (由PE Applied Biosystems制造)。
(2)源自大肠杆菌K-12菌林的肌醇六磷酸酶基因的获取与分泌表达质粒的 构建
源自大肠杆菌K-12菌抹的肌醇六磷酸酶基因的序列既已测定(Genbank Accession No. AE000200:序列号15)。参考该序列，合成序列号7和序列号 8所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备的大 肠杆菌K-12菌抹的染色体DNA中扩增出编码肌醇六磷酸酶序列(成熟型) 的区域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARABIO INC.制造)进行PCR反 应，反应条件采用制造商建议的方案。
然后，使用序列号9和序列号IO所示的引物，采用PCR方法，从按前 述的Saito和Miura的方法制备的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的染色体 DNA中扩增出曱醇脱氢酶的启动子区域和信号序列区域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARABIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造 商建议的方案。为了构建与肌醇六磷酸酶的融合基因，序列号IO所示的引 物包含编码肌醇六磷酸酶N末端侧氨基酸序列的序列。
然后，混合前述扩增出的编码大肠杆菌K-12菌抹肌醇六磷酸酶序列(成 熟型)的区域和前述扩增出的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528曱醇脱氢酶的启 动子区域和信号序列区域的PCR反应液作为^^莫板，使用序列号9和序 列号8的引物进行交换PCR,扩增出与食曱基嗜甲基菌ATCC 53528曱醇脱 氢酶基因的启动子区域和信号序列区域相连的肌醇六磷酸酶的融合基因。 通过琼脂糖凝胶电泳4企测出约2.4 kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.2 (由
TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收该片段，将其插入pHSG398 (由TAKARA BIO INC制造)的Smal位点，从而得到pHSGMappA。对插入 片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融合基因。碱基序列的 测定使用染料终止循环测序试剂盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA 测序仪373A (由PE Applied Biosystems制造)。接下来，使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收pHSGMappA的 BamHI-Kpnl片段，使用DNA blunting Kit (由TAKARA BIO INC.制造)将片 段的末端平端化。接下来，使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC. 制造)从琼脂糖凝胶中回收实施例1 (l)中构建的pAYCTER3的EcoRI片段， 使用DNA blunting Kit (由TAKARA BIO INC.制造)将所述片段的末端平端 化，然后插入已平端化的BamHI-Kpnl片段，从而得到pAYCMappA。按照 前述方法对插入片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的异源融 合基因。
(3)肌醇六磷酸酶基因在食甲基嗜曱基菌ATCC 53528中的表达
用上述(2)中构建的pAYCMappA (通过将源自食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脱氢酶的启动子序列和信号序列与源自大肠杆菌K-12菌抹的 肌醇六磷酸酶基因相连接来获得)及作为对照的pAYCTER3分别转化食曱 基嗜曱基菌ATCC 53528，选择在含25 mg/1氨苄西林和1%曱醇的SEIIA琼 脂培养基(硫酸铵5 g、 K2HP04 1.9 g、 NaH2P04'2 H20 1.56 g、硫酸镁200 mg、 氯化4丐72 mg、硫酸铜5 )ig、硫酸锰25吗、硫酸锌23吗、三氯化铁9,7 mg、 琼脂15g，溶于1LH20，调至pH7.0)上生长的菌抹。接下来，用含25mg/1 氨,西林和2%曱醇的SEIIA液体培养基培养选出的携带pAYCMappA或 pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528,分别于37。C培养48小时。培 养结束后，对携带pAYCMappA或pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的各菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE,结果仅在携带 pAYCMappA的菌抹的培养物上清液中检出了具有目标分子量的蛋白。然 后，以各菌体的培养物上清液为粗酶液，测定其肌醇六磷酸酶活性。酶活 性测定采用已经报导的方法进行(J AOAC Int. 1994 May-Jun; 77(3): 760-4.)。 其结果，对于携带pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528,在其培养物 上清液中未检出酶活性；而对于携带pAYCMappA的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528，检出其培养物上清液中的酶活性为60 FTU/mL (37°C、 pH 5.5),从
而确认了肌醇六磷酸酶分泌至培养物上清液中的事实。
实施例3:源自摩氏摩根氏菌菌林的酸性磷酸酶在食甲基嗜曱基菌ATCC 53528中的分泌表达
(l)源自摩氏摩根氏菌菌林的酸性磷酸酶基因的获取与分泌表达用质粒的构 建
源自摩氏摩根氏菌菌抹的酸性磷酸酶基因的序列既已测定(Genbank Accession No. AB035805:序列号25)。参考该序列，合成序列号27和序列 号28所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备 的摩氏摩根氏菌菌抹的染色体DNA中扩增出编码酸性磷酸酶序列(成熟型) 的区域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反 应，反应条件采用制造商建议的方案。为了构建与食曱基嗜甲基菌曱醇脱 氬酶的融合基因，序列号27所示的引物包含编码曱醇脱氬酶信号序列的C 末端侧氨基酸序列的序列。
然后，使用序列号9和序列号29所示的引物，采用PCR方法，从按前 述的Saito和Miura的方法制备的食甲基嗜曱基菌ATCC 53528的染色体 DNA中扩增出甲醇脱氢酶的启动子区域和信号序列区域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARABIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造 商建议的方案。
然后，混合前述扩增出的编码摩氏摩根氏菌菌抹酸性磷酸酶序列(成熟 型)的区域和前述扩增出的食曱基嗜甲基菌ATCC 53528曱醇脱氢酶的启动 子区域和信号序列区域的PCR反应液1 )il作为模板，使用序列号9和序列 号28的引物进行交换PCR，扩增出与食曱基嗜曱基菌ATCC 53528曱醇脱 氬酶基因的启动子和信号序列相连的酸性磷酸酶的融合基因。通过琼脂糖 凝胶电泳检测出约1.8 kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收该片段，并且将其插入pHSG398 (由 TAKARA BIO INC.制造)的Smal位点，从而得到pHSGMphoC。对插入片段 进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融合基因。碱基序列的测定 4吏用染津+纟冬止4盾玉不测序i式剂盒(dye terminator cycle sequencing kit;由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序仪373A (由PE Applied Biosystems制 造)。接下来，使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARABIO INC.制造)从琼脂糖 凝胶中回收pHSGMphoC的BamHI-Kpnl片段,使用DNA blunting Kit (由
TAKARA BIO INC.制造)将所述片段的末端平端化。接下来，使用 EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收实施例 l(l)中构建的pAYCTER3的Smal片段，然后将已末端平端化的BamHI-Kpnl 片段插入，从而得到pAYCMphoC。按照前述方法对插入片段进行碱基序列 测定的结果确认构建了如预想的异源融合基因。 (2)酸性磷酸酶基因在食曱基嗜曱基菌ATCC 53528中的表达
用上述(l)中构建的pAYCMphoC (通过将源自食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脱氢酶的启动子序列和信号序列与源自摩氏摩根氏菌菌株的 酸性磷酸酶基因相连接来获得)及作为对照的pAYCTER3分别转化食曱基 嗜曱基菌ATCC 53528，选择在含25 mg/1氨苄西林和1%曱醇的SEIIA琼脂 培养基上生长的菌抹。接下来，用含25 mg/1氨千西林和2%曱醇的SEIIA 液体培养基培养选出的携带pAYCMphoC或pAYCTER3的食甲基嗜曱基菌 ATCC 53528,分别于37。C培养48小时。培养结束后，对携带pAYCMphoC 或pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的各菌体的培养物上清液进 行SDS-PAGE,仅在携带pAYCMphoC的菌抹的培养物上清液中检出了具有 目标分子量即约25 kDa的蛋白。然后，以各菌体的培养物上清液为粗酶液， 使用底物pNPP测定其磷酸酶活性，其结果对于携带pAYCTER3的食曱 基嗜曱基菌ATCC 53528,在其培养物上清液中未检出酶活性；而对于携带 pAYCMphoC的食甲基嗜曱基菌ATCC 53528，在其培养物上清液中检出了 酶活性，从而确认了酸性磷酸酶分泌至培养物上清液中的事实。 实施例4:源自更换了信号序列的大肠杆菌K-12菌林的肌醇六磷酸酶在食 曱基嗜甲基菌ATCC 53528中的分泌表达
(l)源自更换了信号序列的大肠杆菌K-12菌抹的肌醇六磷酸酶的分泌表达 质粒的构建
使用序列号30和序列号31所示的引物，采用PCR方法，从按前述的 Saito和Miura的方法制备的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的染色体DNA中 扩增出曱醇脱氢酶的启动子区域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIOINC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。序列号30 所示的引物中包含限制酶HindIII的识别序列。
为了利用源自大肠杆菌K-12菌抹的肌醇六磷酸酶的信号序列，使用序 列号32和序列号33所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备的大肠杆菌K-12菌株的染色体DNA中扩增出包含信号序列的 肌醇六磷酸酶基因。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造) 进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。为了构建与食曱基嗜曱 基菌曱醇脱氢酶的融合基因，序列号32所示的引物包含编码曱醇脱氢酶启 动子序列的C末端侧氨基酸序列的序列，并且序列号33所示的引物包含限 制酶KpnI的识别序列。
然后，混合前述扩增出的编码大肠杆菌K-12菌抹的肌醇六磷酸酶序列 的区域和前述扩增出的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528曱醇脱氢酶的启动子 区域的PCR反应液lpl作为模板，使用序列号30和序列号33的引物进行 交换PCR,扩增出与食曱基嗜甲基菌ATCC 53528的曱醇脱氢酶基因的启动 子相连的大肠杆菌肌醇六磷酸酶的信号序列和成熟基因的融合基因。通过 琼脂糖凝胶电泳检测出约2.4 kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.2 (由 TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收该HindIII-KpnI片段，并且将 其插入实施例1(1)的pAYCTER3的HindIII-KpnI位点，从而得到 pAYCAappA。对插入片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融 合基因。石威基序列的测定使用染料终止循环测序试剂盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序4义373A(由PE Applied Biosystems制造)。
另 一方面，为了利用源自摩氏摩根氏菌菌抹的酸性磷酸酶的信号序列， 使用序列号34和序列号28所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito 和Miura的方法制备的摩氏摩根氏菌菌抹的染色体DNA中扩增出包含信号 序列的酸性磷酸酶基因。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC. 制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。为了构建与食曱基 嗜曱基菌曱醇脱氢酶的融合基因，序列号34所示的引物包含编码甲醇脱氢 酶的启动子序列的C末端侧氨基酸序列的序列。
混合前述扩增出的酸性磷酸酶基因和前述的曱醇脱氢酶的启动子区域 的PCR反应液lpl作为模板，使用序列号30和序列号28的引物进行交换 PCR，扩增出与食曱基嗜甲基菌ATCC 53528的曱醇脱氢酶基因的启动子相 连的摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶的信号序列和成熟基因的融合基因。进一 步，以该融合基因为模板，使用序列号30和序列号35所示的引物扩增出 食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脱氢酶基因的启动子和摩氏摩根氏菌 的酸性磷酸酶的信号序列部分。为了构建与大肠杆菌肌醇六磷酸酶的融合
基因，序列号35所示的引物包含编码肌醇六磷酸酶成熟型序列的N末端侧 氨基酸序列的序列。
混合前述扩增出的曱醇脱氢酶的启动子区域与酸性磷酸酶的信号序列 的融合基因和在实施例2(2)中扩增出的肌醇六磷酸酶基因的PCR反应液 作为模板，使用序列号30和序列号33的引物进行交换PCR，扩增出与食 曱基嗜曱基菌ATCC 53528曱醇脱氬酶基因的启动子相连的摩氏摩根氏菌 酸性磷酸酶的信号序列与大肠杆菌肌醇六磷酸酶成熟基因的融合基因。通 过琼脂糖凝胶电泳检测出约2.4 kb的扩增片段。用限制酶HindIII和Kpnl 处理该扩增片段，使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂 糖凝胶中回收HindIII-KpnI片段，并且将其插入实施例1 (l)中获得的 pAYCTER3的Hindin-Kpnl位点，从而得到pAYCCappA。对插入片段进行 碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融合基因。碱基序列的测定使用 染料终止循环测序试剂盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序仪 373A(由PE Applied Biosystems制造)。
(2)与大肠杆菌肌醇六磷酸酶的信号序列及摩氏摩根氏菌酸性磷酸酶的信号 序列相连的大肠杆菌成熟型肌醇六磷酸酶在食曱基嗜曱基菌ATCC 53528 中的表达
用上述(l)中构建的pAYCAappA (通过将源自食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脱氢酶的启动子序列和源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶的信号 序列与成熟型序列的基因相连接来获得)、和pAYCCappA (通过将源自食甲 基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脱氢酶的启动子序列和源自摩氏摩根氏菌 的酸性磷酸酶的信号序列与源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶的成熟型序列的 基因相连接来获得)及作为对照的pAYCTER3分别转化食甲基嗜甲基菌 ATCC 53528，选择在含25 mg/1氨千西林和1%曱醇的SEIIA琼脂培养基上 生长的菌林。接下来，用含25 mg/1氨苄西林和2%曱醇的SEIIA液体培养 基培养选出的携带pAYCAappA或pAYCCappA或pAYCTER3的食曱基嗜 曱基菌ATCC 53528，分别于37。C培养48小时。培养结束后，对携带 pAYCAappA或pAYCCappA或pAYCTER3的食甲基嗜曱基菌ATCC 53528 的各菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE，结果仅在携带pAYCAappA和携 带pAYCCappA的菌抹的培养物上清液中检出了具有目标分子量的蛋白。然 后，以各菌体的培养物上清液为粗酶液，测定其肌醇六磷酸酶活性，其结
果对于携带pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528，在其培养物上清 液中未4企出酶活性；而对于携带pAYCAappA和携带pAYCCappA的食曱基 嗜曱基菌ATCC 53528，分别在其培养物上清液中检出了酶活性，从而确认 了肌醇六磷酸酶分泌至培养物上清液中的事实。酶活性的测定方法与前述 实施例2中记载的方法相同。
实施例5:源自大肠杆菌K-12菌抹的更换了启动子的肌醇六磷酸酶在食曱 基嗜曱基菌ATCC 53528中的分泌表达
(l)源自大肠杆菌K-12菌抹的更换了启动子的肌醇六磷酸酶的分泌表达质 粒构建
为了利用tac启动子，以pKK223-3 (由Pharmacia制造)为模板，使用序 列号36和序列号37所示的引物，采用PCR方法，扩增出tac启动子区域。 所使用的tac启动子的序列如序列号12所示。使用Pyrobest DNA聚合酶(由 TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。 序列号36所示的引物中包含限制酶EcoRI的识别序列。
以实施例2 (2)得到的pAYCMappA为模板，使用序列号38和序列号39 所示的引物，采用PCR方法，扩增出源自食曱基嗜曱基菌的曱醇脱氢酶的 信号序列与源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶(成熟型)的融合基因。使用 Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件 采用制造商建议的方案。为了构建与tac启动子的融合基因，序列号38所 示的引物包含tac启动子的一部分的序列，而序列号39所示的引物包含限 制酶EcoRI的识别序列。
然后，混合前述扩增出的编码tac启动子序列的区域和前述扩增出的编 码源自食曱基嗜曱基菌的曱醇脱氢酶的信号序列与源自大肠杆菌的肌醇六 磷酸酶(成熟型)的融合基因的区域的PCR反应液1 (il作为模板，使用序列号 36和序列号39的引物进行交换PCR，扩增出与tac启动子相连的源自食曱 基嗜曱基菌的曱醇脱氢酶的信号序列与源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶的成 熟基因的融合基因。通过琼脂糖凝胶电泳检测出约1.6 kb的扩增片段。用 EcoRI处理该扩增片段，然后使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC. 制造)从琼脂糖凝胶中回收所述EcoRI片段，并且将其插入实施例l(l)获得 的pAYCTER3的EcoRJ位点，/人而得到pAYCPtacMappA。对插入片,殳进4亍 碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融合基因。碱基序列的测定使用
染料终止循环测序试剂盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序仪 373A(由PE Applied Biosystems制造)。
(2)与tac启动子相连的源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶在食曱基嗜曱基菌 ATCC 53528中的表达
用上述(l)中构建的pAYCPtacMappA (通过将tac启动子序列和源自食 曱基嗜甲基菌ATCC 53528的曱醇脱氢酶的信号序列与源自大肠杆菌的肌 醇六磷酸酶的成熟型序列的基因相连接得到)及作为对照的pAYCTER3分 别转化食曱基嗜曱基菌ATCC 53528菌抹，选择在含25 mg/1氨千西林和1% 曱醇的SEIIA琼脂培养基上生长的菌抹。接下来，用含25mg/l氨千西林和 2%曱醇的SEIIA液体培养基培养选出的携带pAYCPtacMappA或 pAYCTER3的食甲基嗜曱基菌ATCC 53528，分別于37。C培养48小时。培 养结束后，对携带pAYCPtacMappA或pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的各菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE,仅在携带pAYCPtacMappA 的菌抹的培养物上清液中检出了具有目标分子量的蛋白。然后，以各菌体 的培养物上清液为粗酶液，测定其肌醇六磷酸酶活性，其结果对于携带 pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528，在其培养物上清液中未检出酶 活性；而对于携带pAYCPtacMappA的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528,在其 培养物上清液中检出了酶活性，从而确认了肌醇六磷酸酶分泌至培养物上 清液中的事实。酶活性的测定方法与前述实施例2中记载的方法相同。 实施例6:源自大肠杆菌K-12菌抹的p-内酰胺酶在糖原甲基菌ATCC 29475 中的分泌表达
(l)在糖原甲基菌ATCC 29475中发挥功能的表达质粒pAYCTER-tet的构建 糖原曱基菌ATCC 29475菌抹具有氨苄西林和链霉素抗性，但对四环素 敏感，因此将四环素抗性基因导入实施例1 (l)中制备的分泌表达质粒 pAYCTER3。以pRK310 (见Plasmid. 1985 Mar; 13(2): 149-53)为冲莫板，使用 序列号23和序列号24的引物，采用PCR方法，扩增出四环素抗性基因。 通过琼脂糖凝胶电泳^^测出约1.5 kb的扩增片段。用限制酶BamHI处理该 扩增片段，然后使用EASYTRAPVer.2(由TAKARABIO INC.制造)从琼脂糖 凝胶中回收所述片段，并且将其插入实施例1 (l)得到的pAYCTER3的 BamHI位点，从而得到pAYCTER-tet。对插入片段进行石咸基序列测定的结 果确认构建了如预想的融合基因。序列号23和序列号24所示的引物包含
限制酶BamHI的识别序列。碱基序列的测定使用染料终止循环测序试剂盒 (由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序仪373A (由PE Applied Biosystems制造)。
(2)卩-内酰胺酶在糖原曱基菌ATCC 29475中的分泌表达
用在上述(l)中构建的pAYCTER-tet转化糖原曱基菌ATCC 29475,选揭， 在含5 mg/1四环素和1%曱醇的SEIIA琼脂培养基(硫酸铵5 g、K2HP04 1.9 g、 NaH2P04.2H20 1.56 g、硫酸镁200mg、氯化钙72mg、硫酸铜5吗、硫酸 锰25吗、硫酸锌23吗、三氯化铁9.7mg、琼脂15g，溶于1 LH20，调至 pH7.0)上生长的菌株。接下来，用含5mg/l四环素和2。/。曱醇的SEIIA液体 培养基培养选出的携带pAYCTER-tet的糖原甲基菌ATCC 29475,培养条件 为30°C、 48小时。培养结束后，对携带pAYCTER-tet的糖原曱基菌ATCC 29475的菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE ，可以检测出培养物上清中含 有与(3-内酰胺酶同分子量的蛋白。使用蛋白测序仪PPSQ-21A (由岛津制作 所制造)测定该蛋白的N末端序列，结果确定其为p-内酰胺酶的成熟型序列， 从而确认了 )3-内酰胺酶分泌至培养物上清液中的事实。 实施例7:源自大肠杆菌K-12菌抹的肌醇六磷酸酶在糖原曱基菌ATCC 29475中的分泌表达
(1) 糖原曱基菌ATCC 29475中源自大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶的分 泌表达质粒的构建
为了在糖原曱基菌ATCC 29475菌抹中分泌表达源自大肠杆菌的肌醇 六磷酸酶，将实施例6(1)中制备的四环素抗性基因的BamHI处理片段插入 实施例5(1)中制备的肌醇六磷酸酶分泌表达质粒pAYCPtacMappA的BamHI 位点，从而得到pAYCPtacMappA-tet。对插入片段进行碱基序列测定的结果 确认构建了如预想的融合基因。碱基序列的测定使用染料终止循环测序试 剂盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序仪373A (由PE Applied Biosystems制造)。
(2) 源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶在糖原甲基菌ATCC 29475中的表达
用上述(1)中构建的pAYCPtacMappA-tet或作为对照的实施例6(2)中构 建的pAYCTER-tet分别转化糖原曱基菌ATCC 29475，选择在含5 mg/1四环 素和1%甲醇的SmiA琼脂培养基上生长的菌抹。接下来，用含5mg/l四环 素和2Q/。曱醇的SEIIA液体培养基培养选出的携带pAYCPtacMappA-tet或
pAYCTER-tet的糖原曱基菌ATCC 29475,分别于37。C培养48小时。培养 结束后，对携带pAYCPtacMappA-tet或pAYCTER-tet的糖原曱基菌ATCC 29475的各菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE，结果仅在携带 pAYCPtacMappA-tet的菌抹的培养物上清液中检出了具有目标分子量的蛋 白。然后，以各菌体的培养物上清液为粗酶液，测定其肌醇六磷酸酶活性， 其结果对于携带pAYCTER-tet的糖原曱基菌ATCC 29475,在其培养物上 清液中未检出酶活性；而对于携带pAYCPtacMappA-tet的糖原曱基菌ATCC 29475,在其培养物上清液中检出了酶活性，从而确认了肌醇六磷酸酶分泌 至培养物上清液中的事实。酶活性的测定方法与前述实施例2中记载的方 法相同。 工业实用性
通过本发明可以廉价、高效地进行蛋白质的分泌生产。特别是可以高 效地分泌生产具有产业价值的蛋白质，例如肌醇六磷酸酶等。
权利要求
1.一种蛋白质的生产方法，该方法包括通过在以甲醇为主要碳源的液体培养基中培养携带DNA构建体的甲醇同化细菌，使该细菌分泌目的蛋白，其中所述DNA构建体包含在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子序列和以可表达的形式连接于该启动子序列的、编码包括信号序列和所述目的蛋白序列的多肽的核酸序列；和回收分泌的目的蛋白。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述在曱醇同化细菌中发挥功能的启 动子序列选自曱醇脱氢酶的启动子、tac启动子、oE启动子和核糖体蛋白启 动子。
3. 根据权利要求1的方法，其中所述启动子序列为具有序列号11、 12、 21或22的》威基序列的启动子。
4. 根据权利要求1 3任一项的方法，其中所述信号序列为选自曱醇脱 氢酶、肌醇六磷酸酶和酸性磷酸酶的蛋白质的信号序列。
5. 根据权利要求1 3任一项的方法，其中所述信号序列具有选自序列 号18和20的氨基酸序列。
6. 根据权利要求1 5任一项的方法，其中所述甲醇同化细菌为选自下 组的细菌嗜曱基菌属(methylophilus)细菌、曱基菌属(methylobacillus)细菌、 逸曱基菌属(methylophaga)细菌、无色杆菌属achromobacter细菌、々i单月包 菌属(pseudomonas)纟田菌、精朊杆菌属(protaminnobacter)纟田菌、曱烷单胞菌 属(methanomonas纟田菌、微环菌属(microcyclus力纟田菌和甲基杆菌属 (methylobacterium)纟田菌。
7. 根据权利要求1 6任一项的方法，其中所述蛋白为选自肌醇六磷酸 酶、白细胞介素、转谷氨酰胺酶、干扰素、胰岛素、酸性磷酸酶和肽合成 酶(peptide synthase)的蛋白。
8. 根据权利要求1 7任一项的方法，其中所述曱醇同化细菌为专性甲 醇同化细菌。
9. 根据权利要求8的方法，其中所述专性曱醇同化细菌为选自下组的 细菌嗜曱基菌属(methylophilus力细菌、甲基菌属(methylobacillus力细菌和噬甲基菌属methylophaga细菌
全文摘要
通过在以甲醇为主要碳源的液体培养基中培养携带DNA构建体的甲醇同化细菌，使该细菌分泌目的蛋白，其中所述DNA构建体包含可在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子序列和以可表达的形式连接于该启动子序列的、编码包括信号序列和目的蛋白序列的多肽的核酸序列；和将分泌的目的蛋白回收。
文档编号C12P21/02GK101175859SQ20068001631
公开日2008年5月7日 申请日期2006年5月12日 优先权日2005年5月12日
发明者伊达雅代, 板屋宽, 菊池庆实 申请人:味之素株式会社