专利名称：蛋白质生产方法
技术领域：
本发明涉及改变蛋白质细胞分泌速率的方法。
背景技术：
蛋白质例如抗体的大规模生产通常依赖于蛋白质自培养的生产 细胞系的分泌。可容易的自周围细胞培养基回收及纯化培养细胞产 生的分泌性蛋白质。
蛋白质的细胞表达速率是影响自生物反应器或其他体系生产和 纯化分泌性蛋白质的一个重要参数。通常，如果细胞表达比较高则 可获得更高纯度的蛋白质产量。相反，如果细胞表达速率过低则蛋 白质可能不适于纯化。分离高表达、亚克隆细胞。通常，需要有限的系列稀释、高表达细 胞系筛查和选择的数个费时、费力的循环。或者，制备产目的蛋白 的全新的细胞系并希望产生的新细胞系为高表达细胞系。上述每个制备高表达细胞系的方法均有局限性。例如，高表达 细胞在群体中相对稀少以及鉴别任何高表达细胞均需要大量时间和 劳力限制了从大量低表达细胞中通过亚克隆鉴别高表达细胞系。进一步的，新细胞系不是高表达的可能性以及再生产生抗体的 细胞和鉴别高表达细胞将需要非常大量的劳力限制了产生抗体或感 兴趣蛋白质的新细胞系的制备。在一些实例中，尽管努力获得高表 达细胞系但仅可得到低表达细胞系。因此需要改变蛋白质的细胞分泌速率的有效方法。
附图简述
图1显示相对于Sp2/0亲代骨髓瘤细胞系在高表达细胞系中提高了的SLPI基因转录水平。图2显示相对于Sp2/0亲代骨髓瘤细胞系在高表达细胞系中提高 了的CD53基因转录水平。图3显示相对于Sp2/0亲代骨髓瘤细胞系在高表达细胞系中增加 了的转4失蛋白-l生成。图4显示相对于C463a亲代骨髓瘤细胞系在高表达细胞系中提 高了的SLPI基因转录水平。图5显示在C463a衍生亚克隆中抗体产生增加时SLPI基因转录 水平逐渐增加的趋势。图6显示相对于C463a亲代骨髓瘤细胞系在高表达细胞系中增加了的转铁蛋白-1基因转录水平。图7显示在C463a衍生亚克隆中抗体产生增加时转铁蛋白-1基因转录水平逐渐增加的趋势。发明概述本发明的 一个方面是一种改变蛋白质细胞分泌速率的方法，包 括调节至少一种选自细胞中分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、 CD53或转铁蛋白-1的分子的活性及培养细胞的步骤。本发明的另 一个方面是一种带有改变细胞分泌速率的骨髓瘤细 胞，通过调节至少一种选自细胞中分泌性白细胞蛋白酶抑制剂 (SLPI)、 CD53或转铁蛋白-1的分子的活性及培养细胞的步骤生成。发明详述说明书中引用的包括但不限于专利和专利申请书的所有公开通 过引用其全部内容结合到本文中。文中所用"抗体"指其宽广的含义且包括免疫球蛋白或抗体分 子，包括多克隆抗体，单克隆抗体，包括鼠类、人、人源化及嵌合 单克隆抗体及抗体片段或变异体。抗体为构成性表达的分泌性蛋白 质且通过浆细胞分泌。也可4吏用无限增殖化浆细胞通过标准方法例 如杂交瘤增殖或通过将抗体重链或轻链基因转染入无限增殖化B细
胞例如骨髓瘤细胞或其他细胞类型例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、植 物细胞及昆虫细胞产生抗体。
抗体片段或变异体包括模拟抗体(mimetibodie)、 Fab片段、F (ab')2 片段、Fc片段、重链片段、轻链片段和含有至少一种抗体肽链的一 部分的分子。这些部分可与抗体可变区、铰链区或恒定区肽链相对 应。
文中所用术语"模拟抗体"指具有通式(I)的蛋白质 (Vl(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n》(m)(I)
其中VI至少为免疫球蛋白可变区N-末端的一部分，Pep为至少一种 结合到表位的活性肽，Flex为使模拟抗体具有选择定向及结合特性 提供结构柔性的多肽，V2至少为免疫球蛋白可变区C-末端的一部 分，pHinge至少为免疫球蛋白铰链区的一部分，CH2至少为免疫球 蛋白CH2恒定区的一部分且CH3至少为免疫球蛋白CH3恒定区的 一部分，其中n和m可为1-10间的整数。模拟抗体可依靠构建体中 存在的重链恒定区氨基酸序列摹拟不同类型免疫球蛋白分子例如 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA、 IgM、 IgD及IgE的性质和功能。
文中所用术语"单克隆抗体"(mAb)指得自大量基本同源抗体的 抗体(或抗体片段)。单克隆抗体是高度特异的、通常定向于单一抗原 决定簇。修饰语"单克隆"表示抗体的基本同源特性且不需要任何 特定方法产生抗体。例如，可通过Kohler等,淑騰256: 495 (1975) 的杂交瘤方法制备鼠类mAbs。可通过美国专利No. 4，816, 567公开 的方法制备含有得自供体抗体(通常为鼠)的轻链和重链可变区以及得 自受体抗体(通常为另 一种哺乳动物种例如人)的轻链和重链恒定区的 嵌合mAbs。可通过Queen等，iV加/爿cad Scz (USA), 86: 10029-10032, (1989)和Hodgson等，S/o/rec^o/ogy, 9: 421, (1991)中公开的技 术获得人源化mAbs,其具有得自非人供体免疫球蛋白(通常为鼠)的 CDRs及余下的分子的免疫球蛋白来源的部分得自 一种或多种人免疫
球蛋白，任选具有改变的构架支持体残基以保存结合亲和力。可参考例如Lonberg等，iV"rt^ 368 : 856-859, (1994); Fishwild等， 淑廳胸ec/wo/ogy 14 : 845-851, (1996)'及Mendez等，淑, Ge""/" 15 : 146-156， (1997)中技术自人免疫球蛋白转基因鼠制备缺 乏非人序列的完全人mAbs。也可通过参考例如Kn叩pik等，A/o/. 5/o/. 296 : 57-86, (2000)和Krebs等，/wmw"o/. A/e仇254: 67- 84, (2001)中技术自噬菌体展示文库制备及优化人mAbs。本文所用术语"细胞表达水平"指细胞在整个生存期能表达的 给定蛋白质的量。这个量可描述为每段时间变量内培养基中存在的 蛋白质量的变化(即"体积生产率"("volumetric productivity"))或者 可标准化为细胞数目(即"特定生产率"("specific productivity"))。可 用单位"mg/ml/天"表示"体积生产率"而可用单位"pg/细胞/天" 表示"特定生产率"。本发明提供了适于改变细胞蛋白质细胞表达的量的方法。本发 明方法的示例性应用是增加适于治疗、诊断或研究目的的蛋白质例 如抗体的表达量。高通量cDNA微阵分析提供一种鉴别通常在不同高表达、产抗体细胞系中受调节的基因的技术。这种分析显示所有已知鼠类基因 中，不到0.1%通常在具高分泌速率的不同SP2/0及C4Ma衍生鼠类 骨髓瘤细胞系中受到调节。编码分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI) (Genbank检索号NM 011414), CD53(Genbank检索号NM 0C)7651)及 转铁蛋白-l(Genbank检索号J03299)蛋白质的基因属于这种通常受调 基因的精选组。在cDNA微阵分析中发现这些基因在所检测的SP2/0 及C463a衍生高表达细胞系中增量调节。相对于亲代鼠类骨髓瘤细 胞系在所检测的高表达细胞系中这些基因均增量调节至至少1.5倍。SLPI蛋白通过诱导细胞周期蛋白D,减量调节TGF-P，且抑制 编码赖氨酰氧化酶基因诱导通过Ras信号转导途径的信号转导增加 细胞增殖。CD53蛋白是四次跨膜蛋白(tetraspanin)家族蛋白质的细胞
表面表达成员且似乎能够触发生存反应及降低进入细胞凋亡的细胞数目。也已经提出了 CD53的其他功能例如细胞激活、离子通道形 成及小分于运输。转铁蛋白-1是主要的铁运输蛋白质，提供支持细 胞增殖需要的铁。然而不希望受限于任何特定理论，申请人相信 SLPI、 CD53及转铁蛋白-1基因的一种或几种的增量调节通过提高活 细胞数目而提高抗体表达。在本发明方法中，通过调节至少一种选自细胞中SLPI、 CD53或 转铁蛋白-1的分子活性并培养该细胞改变蛋白质的细胞表达速率。 本发明此方法用于提高或降低蛋白质例如抗体的细胞表达速率。在本发明的一个实施方案中，通过用编码SLPI、 CD53或转铁蛋 白-1的核酸转染细胞提高蛋白质的细胞表达速率。可通过本领域技 术人员已知的标准方法例如脂质转染法或电穿孔法，或病毒转化法 完成转染。这些方法可产生稳定或短暂转染的细胞。在本发明方法中产生类似SLPI、 CD53或转铁蛋白-1亲代分子 活性的SLPI、 CD53或转铁蛋白-1蛋白质或核酸序列的变异体也是 有利的。例如，具有对亲代分子或蛋白质相关家族至少80%同一性 的变异体分子预期具有相似活性。可使用关闭滤波且所有其他默认 设为未改变的BLAST算法测定两种蛋白质序列间百分同一性。部分 亲代分子变异体的实例为多肽不同亚型，多肽显性失活型或多肽的 共价修饰形式。在本发明另一个实施方案中，可通过降低SLPI、 CD53或转铁蛋 白-1分子的表达或活性降低蛋白质的细胞分泌速率。可通过给予细 胞干扰RNA (iRNA)分子降低这些分子的表达或活性。例如，iRNA 分子可为小干扰RNA (siRNA)或反义分子。本领域技术人员已熟知 给予iRNA分子的方法例如转染技术。在本发明方法中，示例性细胞为浆细胞，即能够表达抗体的分 化型B细胞。通常，此浆细胞通过标准技术例如用Epstein-Ban病毒 病毒感染或其他技术例如放射或化学诱变而无限增殖。这种无限增
殖浆细胞也可为癌性的且可通过矿物油或其他化合物注射进动物腹 膜腔获得。在本发明的一个实施方案中，浆细胞为本领域已知的"骨髓瘤 细胞"。本领域中术语"骨髓瘤细胞"指自带有多发性骨髓瘤的生 物体获得或衍生的癌性浆细胞，也指这种癌性浆细胞与另一种细胞(例如抗体产生BALB/c小鼠脾细胞或用编码抗体核酸稳定转染的真核 细胞)融合形成的杂交瘤细胞。骨髓瘤细胞系的实例包括SP2/0 (美国 模式培养物保藏所((ATCC)， Manasas, VA, CRL-1581)、 NSO (欧洲细 胞培养物保藏所(ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC No. 85110503)及得自小鼠的Ag653 (ATCC CRL-1580)细胞系。得自人的 骨髓瘤细胞系的实例为U266细胞系(ATTC CRL-TIB-196)。这种C463a 骨髓瘤细胞系是一种能在化学上已知成份培养液中生长的SP2/0衍生 细胞系的实例。本领域技术人员将识别其他骨髓瘤细胞系。骨髓瘤细胞可用于生产能产生蛋白质例如抗体的亚克隆或杂交 瘤。可通过有限系列稀释或本领域熟知的其他技术完成亚克隆。可 通过Kohler等，Atow" 256 : 495 (1975)的方法或本领域已知的其他 技术获得杂交瘤。可通过包含编码抗体的核酸序列的亚克隆或杂交 瘤生产抗体。这种核酸序列可整合进染色体DNA，或存在于生产抗 体的亚克隆或杂交瘤的染色体外。在本发明的一个实施方案中，用核酸例如DNA序列稳定转染骨 髓瘤细胞。可通过本领域普通技术人员熟知的转染、筛查及选择的 方法生产稳定转染的骨髓瘤细胞。用来稳定转染细胞的DNA序列可 随机整合进骨髓瘤细胞DNA或以位点专一方式整合。这种DNA序 列可编码SLPI、 CD53或转铁蛋白-1分子或能够降低SLPI、 CD53 或转铁蛋白-1活性的iRNA。在本发明方法中，细胞为培养的。可悬浮培养或贴壁培养细胞。 可在各种容器中培养细胞，例如生物反应器、细胞袋(cell bags)、培 养皿、烧瓶以及本领域普通技术人员熟知的其他容器。可在IMDM (Invitrogen,目录号UM0-3)中或任何其他适当的培养基包括化学成 分确定的培养液制剂中培养细胞。本领域技术人员已熟知适于细胞 培养的环境条件例如温度及大气组分。本领域技术人员也已熟知细 胞培养的方法。骨髓瘤细胞。
现在将参考下列特定的、非限制性实施例描述本发明。
实施例1
在高表达SP2/0衍生细胞系中SLPI基因转录水平
cDNA微阵分析表明相对于亲代SP2/0骨髓瘤细胞系在SP2/0衍 生高表达细胞中SLPI基因转录水平增加。为证实这一发现，经定量 PCR (Q-PCR)测评高表达细胞系和亲代SP2/0骨髓瘤细胞中SLPI基 因转录水平。所检测的高表达细胞系包括得自鼠类SP2/0骨髓瘤细胞 系的表达抗体的C128D、 C62、 C379B、 C466D及C524细胞系。在 标准条件下在含有血清培养基中培养细胞。
图1中结果显示相对于亲代SP2/0骨髓瘤细胞系在SP2/0衍生高 表达细胞系中SLPI基因转录水平更高。
实施例2
在高表达SP2/0衍生细胞系中CD53基因转录水平
cDNA微阵分析表明相对于亲代SP2/0骨髓瘤细胞系在SP2/0衍 生高表达细胞中CD53基因转录水平增加。为证实这一发现，经Q-PCR 测评高表达细胞系和亲代SP2/0骨髓瘤细胞中CD53基因转录水平。 所检测的高表达细胞系包括按抗体产率逐渐提高的顺序排列的 175a、 175-88和175G，在7天的培养中表达量分别12mg/L、 60mg/L 和110mg/L。这些细胞系得自鼠类SP2/0骨髓瘤细胞系。
图2中结果显示相对于亲代SP2/0骨髓瘤细胞系在SP2/0衍生高 表达细胞系中CD53基因转录水平更高。
实施例3 在高表达SP2/0衍生细胞系中增加的抗体分泌相对于SP2/0亲代骨髓瘤细胞系在高表达SP2/0衍生细胞系中 增加了的抗体产生(图3)。图1和图3的比较表明SLPI基因转录水 平的提高倍数似乎与使用C128D、 C62、 C379B、 C466D和C524细 胞系观测的抗体分泌速率相关。为测定体积生产率，细胞接种在新鲜培养基中且在摇瓶中培养7 天。第7天通过标准测定方法测定培养基中抗体浓度。图3中结果 代表抗体产生的体积生产率且部分代表7天培养期中抗体分泌速率 的测量值。实施例4在高表达C463a衍生细胞系中SLPI基因转录水平cDNA微阵分析表明相对于亲代C463a骨髓瘤细胞系在C463a 衍生高表达细胞中SLPI基因转录水平增加。为证实这一发现，经Q-PCR测评高表达细胞系和亲代C463a骨髓瘤细胞中SLPI基因转录水 平。所检测的高表达细胞系包括得自鼠类C463a骨髓瘤细胞系的表 达抗体的C743b、 C744b、 C524、 C526、 C893a及C893c细胞系。C463a 骨髓瘤细胞系是一种能够在化学上已知成份培养液中生长的SP2/0 衍生细胞系。在标准条件下在缺乏血清的化学上已知成份培养液中 培养细胞。图4中结果显示相对于亲代C463a骨髓瘤细胞在大多数C463a 衍生高表达细胞系中SLPI基因转录水平更高。实施例5在C463a衍生细胞系中随亚克隆抗体生成增加SLPI基因转录水平提高的趋势图5中结果显示在单个C463a衍生细胞系中随抗体生成增加SLPI 基因转录水平提高的趋势。经Q-PCR测评高表达细胞系及亲代C463a 骨髓瘤细胞(宿主)中SLPI基因转录水平。所检测的高表达细胞系包 括按抗体产率逐渐提高的顺序排列的表达第一抗体(抗体1)"起始"
细胞系，产生"最终"笫一抗体的细胞系，及产生"最终，，第二抗体(抗体2)的细胞系。所有这些细胞系得自鼠类C463a骨髓瘤细胞系。 在标准条件下在缺乏血清的化学上已知成份培养液中培养细胞。实施例6在高表达C463a衍生细胞系中转铁蛋白-1基因转录水平cDNA微阵分析表明相对于亲代C463a骨髓瘤细胞系在C463a 衍生高表达细胞中转铁蛋白-1基因转录水平增加。为证实这一发现， 经Q-PCR测评高表达细胞系和亲代C463a骨髓瘤细胞中转铁蛋白-1 基因转录水平。所检测的高表达细胞系包括得自鼠类C463a骨髓瘤 细胞系的表达抗体的C743b、 C744b、 C524、 C526、 C893a及C893c 细胞系。在标准条件下在缺乏血清的化学上已知成份培养液中培养 细胞。图4中结果显示相对于亲代C463a骨髓瘤细胞在C463a来源的 高表达细胞系中转铁蛋白-1基因转录水平更高。实施例7在C463a衍生细胞中随亚克隆抗体产生增加转铁蛋白-1基因转录水平增加的趋势图7中结果显示在C463a衍生细胞中随亚克隆抗体产生增加转 铁蛋白-1基因转录水平增加的趋势。经定量PCR (Q-PCR)测评高表 达细胞系中及亲代C463a骨髓瘤细胞(标记"宿主"的棒图)中转铁蛋白-1基因转录水平。所检测的高表达细胞系包括按抗体产率逐渐提高的 顺序排列的表达抗体1及第三抗体(抗体3)的"早期"细胞系和产生 "最终"抗体1和抗体3的细胞系。所有这些细胞系得自鼠类C463a 骨髓瘤细胞系(标记"宿主"的棒图)。在标准条件下在缺乏血清的化学 上已知成份培养液中培养细胞。实施例8SLPI、 CD53或转铁蛋白-1特异性干扰RNA对抗体表达水平的影响针对SLPI、 CD53和转铁蛋白-1基因转录物的干扰RNA分子将 改变净元体表达7jc平。可基于siRNA Target Finder Tool (www. ambion. com/techlib/misc/siRNA—finder, html)4吏用Ambion's internet "i殳i十且可 商业上合成干扰RNA分子。或者，可使用psilencerTMsiRNA构建试 剂盒(Ambion Inc. , Woodward, TX)分离表达siRNA转录物的永久克 隆(permanent clones)。可用编码干扰RNA的核酸分子转染细胞给予 干扰RNA或直接给予干扰RNA。每种方法均可使用标准转染技术。实施例9通过提高SLPI、 CD53转铁蛋白-1基因转录及表达水平提高抗体分泌速率提高细胞中SLPI、 CD53或转铁蛋白-1活性的过度表达或其他 技术将提高蛋白质例如mAbs的细胞分泌速率。可用编码SLPI、 CD53 或转铁蛋白-1的表达载体构建体转染蛋白质表达细胞系例如mAb表 达细胞系从而引起这些蛋白质的过度表达。可单独使用或组合使用 这些表达载体构建体转染细胞。使用标准技术转染后可确定适当的 蛋白质及抗体表达水平。然后可比较转染细胞中蛋白质分泌速率与 非转染对照细胞的分泌速率。预期在过度表达SLPI、 CD53或转铁蛋 白-1中一种或几种分子的细胞中蛋白质分泌速率更高。这样全面描述了本发明，可在不偏离所附权利要求书的精神或见的。
权利要求
1. 一种改变蛋白质表达水平的方法，包括步骤a) 调节细胞中至少 一种选自分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、 CD53或转铁蛋白-1的分子的活性；及b) 培养该细胞。
2. 权利要求1的方法，其中所述蛋白质表达水平提高。
3. 权利要求2的方法，其中所述分子通过用编码SLPI、 CD53 或转铁蛋白-1的核酸转染所述细胞来调节。
4. 权利要求3的方法，其中所述核酸编码具有小鼠SLPI、小鼠 CD53或小鼠转铁蛋白-1的氨基^列的分子。
5. 权利要求4的方法，其中所述核酸具有小鼠SLPI、小鼠CD53 或小鼠转铁蛋白-1的核苷酸序列。
6. 权利要求1的方法，其中所述细胞为骨髓瘤细胞。
7. 权利要求6的方法，其中所述骨髓瘤细胞为Sp2/0、NS0、 Ag653 或C463a。
8. 权利要求6的方法，其中所述骨髓瘤细胞为得自Sp2/0、 NS0、 Ag653或C463a的亚克隆或杂交瘤。
9. 权利要求l的方法，其中所述蛋白质为抗体。
10，权利要求1的方法，其中所述细胞分泌速率降低。
11, 权利要求10的方法，其中所述分子通过给与所述细胞干扰 RNA或编码干扰RNA的核酸来调节。
12. —种带有改变的蛋白质表达水平的骨髓瘤细胞，通过下列步 骤生成a) 调节细胞中至少一种选自分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、 CD53或转铁蛋白-1的分子的活性；及b) 培养该细胞。
全文摘要
公开了用于改变蛋白质例如抗体的细胞分泌速率的方法，以及通过该方法生产的改变的细胞。此方法及改变的细胞用于生产高水平的用于治疗、诊断或研究目的的蛋白质。
文档编号A61K39/395GK101123972SQ200580011512
公开日2008年2月13日 申请日期2005年2月11日 优先权日2004年2月19日
发明者H·多赖 申请人:森托科尔公司