用作蛋白质药物释放的含胶原海绵的制作方法

专利名称：用作蛋白质药物释放的含胶原海绵的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于改进药物持续释放转运的含胶原海绵。
胶原以前已被用作药物海绵中的一种组分。Artandi[美国专利3，157，524，公布于1964年11月17日]公开了一种由酸处理的膨胀胶原组成的海绵。Oluwasanmi等[J.Trauma16348-353(1976)]公开了一种戊二醛交联的1.7毫米厚的胶原海绵。Collins等[Surg.Forum27551-553(1976)]公开了一种戊二醛交联的酸膨胀胶原海绵。Berg等[美国专利4，320，201，公布于1982年3月16日]公开了一种高胶原纯度的膨胀海绵，这种高纯度胶原是经酶解动物皮，在碱或酸中消化这些团块，机械粉碎该团块得到特定长度的胶原纤维并交联这些纤维而生产的。Berg等[美国专利4，837，285，公布于1989年6月6日]公开了具有珠体积1～30%的胶原骨架的多孔珠。这些珠用作细胞生长的基质。Doillon等[ScanningElectronMicroscopyⅢ1313-1320(1984)]，Doillon等[Biomaterials8195-200(1987)]公开了在孔直径大约60到250μm胶原海绵中的细胞生长。这些海绵中的有些也含有透明质酸和/或纤维溶解素(fibronectin)。
此外，胶原已被用作油膏的一种组分[PCT专利申请WO86/03122，公布于1986年6月5日]。胶原还与电流联合用于伤口的愈合[Silver和Dunn，美国专利4，937，323，公布于1990年6月26日]。
另外，现有技术中已使用了含胶原的膜剂。Abbenhaus等，Surg.Forum16477-478(1965)公开了从牛皮中提取的胶原经加热和脱水制备的2到3毫米厚的胶原薄膜。Chu公开了经压缩生产的非化学法交联的胶原移植片，它用来持续药物的释放[欧洲专利申请187014，公布于1986年7月9日;美国专利4，600，533公布于1986年7月15日;美国专利4，655，980，公布于1987年4月7日;美国专利4，689，399，公布于1987年8月25日;和PCT专利申请WO90/00060，公布于1989年6月28日]。Cioca[美国专利4，412，947，公布于1983年11月1日]，公开了经冷冻干燥有机酸中的胶原悬浮液制备的基本上纯的胶原层。Kuroyanagai等[欧洲专利申请167828，公布于1984年1月15日;美国专利4，642，118，公布于1987年2月10日]公开了一种由胶原和一种聚α-氨基酸两层组成的人造皮肤。Berg等[美国专利申请4，841，962，公布于1989年6月27日]，公开了一种由一种胶粘剂，一种交联胶原基质和一种多层聚合物薄膜三层组成的伤口敷料。Holman美国专利4，950，699，公布于1990年8月21日公开了一种由至少10%胶原与一种丙烯酸胶粘剂混合组成的伤口敷料。Cioca等英国专利1，347，582，公开了一种由冷冻干燥的多分散胶原混合物组成的胶原伤口敷料。
Steffan等，欧洲专利069260，公布于1983年1月12日，公开了一种由高纯度天然胶原组成的胶原插入物。Zimmerman等[美国专利4，453，939，公布于1984年6月12日]，公开了一种含有用纤维蛋白质，纤维蛋白质XⅢ因子和/或凝血酶包裹的胶原的伤口愈合组合物。Leibovich等[美国专利4，808，402，公布于1989年2月]，公开了一种含有胶原，生物可侵蚀(bioerodible)聚合物，和肿瘤坏因子的治疗伤口组合物。Yannas和Burkd[J.Biomed.Mat.Res.1468-81(1980)]综述了人造皮肤的设计，一些例子含有胶原。Chvapil等Int.Rev.Connect.TissueRes.61-61(1973)，特别在51到52页;和Pachence等，Med.Deviceand.Diag.Ind.，949-55(1987)，公开了胶原的各种用途，包括作为药物输送载体。
以前所用的含胶原海绵多数被用作伤口部位细胞生长的基质或骨架，而没有被用于运送药物。本发明提供了对药物海绵的一种非常理想的改进，由它可以在一个持久的时期的时间提供治疗剂的一种稳定，连续的持久释放。
本发明涉及包括一种吸收性明胶海绵，胶原，和一种活性成分的一种含胶原海绵。最好的是，这种吸收性明胶海绵是一种交联明胶。
本发明的另一个方面涉及一种还可以包含有一种或多种增塑剂，稳定剂，干燥增强剂或缓冲剂的含胶原海绵。较好的是，增塑剂是选自聚乙二醇和甘油;稳定剂是一种选自于由甘露醇、乳糖和葡萄糖组成的一组中的糖;干燥增强剂是选自于由乙醇、甲醇和异丙醇组成的一组中的一种醇;缓冲剂是一种合适的生物缓冲剂。优选的活性成分是选自于由PDGF，EGF，FGF，PDEGF，PD-ECGF，KGF，IGF-1，IGF-2，TNF，BDNF，CNTF和NT-3组成的一组成份。
本发明的另一方面涉及一种促进表皮伤口愈合的方法，包括借助本发明另一方面的胶原海绵使用一种伤口愈合有效剂量的活性成分。
本发明的其它方面还涉及一种促进内部伤口愈合的方法，包括借助本发明另一方面的胶原海绵使用一种伤口愈合有效剂量的活性成分。


图1显示了体外PDGF从干明胶海绵中释放的分布图。
图2显示了用第一级动力学表示的体外PDGF从干明胶海绵-胶原海绵中释放的分布图。
图3显示了用放射性同位素法，ELISA和PDGF生物测定法测得的PDGF的相互联系。
图4显示了体外PDGF从湿明胶海绵一胶原海绵中释放的分布图。
图5显示了用第一级动力学表示的体外PDGF从湿明胶海绵-胶原海绵中释放的分布图。
图6显示了用放射性同位素法，ELISA和PDGF生物测定法测得的PDGF的相互联系。
图7显示了体外PDGF从不含胶原的明胶海绵中释放分布图。
图8显示了体外PDGF从用1%胶原溶液制备的明胶海绵-胶原体系中释放的分布图。
图9显示了体外PDGF从用8%胶原溶液制备的明胶-胶原系中释放的分布图。
图10显示了用鼠血管丛(boundle)模型所得出的实验结果。
本发明涉及一种含有吸收性明胶海绵，胶原和一种活性成分的含胶原海绵。
一种合适的吸收性明胶海绵是交联明胶，如明胶海绵(Upjohn，Inc.，Kalamzoo，Michigan)。把这种吸收性明胶海绵浸泡在含有胶原和活性成分的溶液中就能把它们结合起来。或者，预先决定了用量的胶原溶液能被转移到明胶海绵上并且该溶液能被吸书。
可溶性胶原是平均分子量低于400，000，最好分子量为300，000左右的胶原。一种特别适用的可溶性胶原是SemexS(SemexMedicalCO.，Malvern，Pennsylvania)。因为这种特殊的可溶性胶原是胶原的非全肽(atelopeptide)形式，所以它也是有益的。非全肽胶原是不含末端肽胶原，它是一种位于常与免疫原性有关的纯化胶原一端的肽。末端肽形式的胶原溶液能够经有机酸水解转化为非全肽形式的胶原。这种可溶性胶原的另一个较好的特征是它有最小量的交联，即，0.5%或更少。
把这种可溶性胶原溶液溶于一种合适溶剂如水可产生一种含有0.5左右到10左右%的胶原，较好为1左右到5左右%，最佳为2%左右的胶原(按重量计)溶液。
可溶性胶原溶液或胶原纤维的胶体悬液被用来浸泡吸收性明胶海绵。一般地，将适量胶原溶液转移到吸收性明胶海绵上面。另一种情况，把胶原溶液倒入装有明胶海绵的容器中。适宜的条件包括让被浸泡海绵在适宜温度适宜时间干燥。通常，升高干燥温度可缩短必要的干燥时间。更详细地说，适宜温度是大约15℃到35℃，最好为室温左右，而适当的干燥时间是足以使溶剂量的临界损耗基本上为零的时间(例如，大约一个小时到10天左右，最好是一天到五天左右的干燥时间)。
为了使优选胶原海绵达到最佳理想特征，在这种胶原溶液中可以包括各种选择性附加剂。这种合乎要求的特征包括柔韧性，稳定性，加速了的干燥时间和与所用的活性成分相容的一个PH值。
为提高柔韧性，可使用一种适当的增塑剂。适当的增塑剂包括聚乙二醇和甘油。优选甘油，这种增塑剂存在的用量是所含胶原重量的0到100%左右，优选10到30%左右，最佳为20%左右。
为了增加活性成份的稳定性，可在薄膜中使用合适的稳定剂。合适的稳定剂包括大多数的糖类，优选甘露醇，乳糖，和葡萄糖，最优选的是甘露醇。这些稳定剂的含量可以是所含胶原重量的0到5%，优选所含胶原重量的1%。
为加快薄膜的干燥时间，可使用一种干燥增强剂。合适的干燥增强剂包括醇类，优选乙醇、甲醇和异丙醇，最佳为乙醇。这种干燥增强剂存在的用量是总溶液或悬浮液重量的0到50%左右，优选10到30%左右，最佳为20%左右。
为产生一个与所用特定活性成分相容的PH值，在该薄膜中能使用一种合适的缓冲剂。合适的缓冲剂包括多数通常已知和所用的生物缓冲剂，优选乙酸盐，磷酸盐和枸橼酸盐，最佳为乙酸盐和磷酸盐。这种缓冲剂存在的用量是该胶原溶液或悬浮液重量的0.01%到2%左右。相容的PH值是能够保持活性成分的稳定性，优化其治疗作用或防止其降解的PH值。适当的PH值通常是3到8左右，优选5到8左右，最佳为7.0到7.5左右的中性PH值。
优选的活性成分是能够促进伤口愈合或神经组织再生的生物剂，特别是重组蛋白质。这种优选活性成分包括来源于血小板的生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，纤维细胞生长因子(FGF)，来源于血小板的一表皮生长因子(PDEGF)，来源于血小板的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，角化细胞生长因子(KGF)，类胰岛素生长因子1和2(IGF-1和IGF-2)，肿瘤坏死因子(TNF)，来源于脑组织的神经营养因子(BDNF)，睫状神经营养因子(CNTF)和神经营养素-3(NT-3)。较好的一种活性成分是PDGF或PD-ECGF，最佳的为PDGF。这种活性成分以足以促进伤口愈合的用量存在，即，伤口愈合的一种有效用量。该活性成分的实际用量将由护理的临床医师决定并取决于各种因素如伤口严重程度，患者的状况，患者的年龄和任何并发性损伤或内科疾病。一般来说，活性成分的用量将在1μg/cm2到5mg/cm2左右的范围内。
本发明的胶原海绵是用作给接触的细胞或组织释放这种活性成分的一种工具。例如，在治疗皮肤烧伤或其他创伤中，把一种胶原海绵放在伤口上来给损伤区域释放一种适宜的活性成分。PDGF是这类用途中特别适宜的活性成分。胶原海绵也能被用来加速外科伤口的愈合。用于这类方法中时，把这种胶原海绵放入外科切口和缝合进伤口作为两外科伤口表面间的一个接触面。胶原海绵也能用来释放神经营养因子。用于这类方法时，把这种胶原海绵放在直接接触或邻近的神经组织来用这种神经营养因子治疗。
实施例实施例1一种胶原海绵的制备用一种金属杆(直径32mm，长130mm)卷起一片明胶海绵(Gelfoam80×250×10mm)，很似生面团制成一种薄片。所得到的这种薄片厚度为1mm。用一种黄铜制的冲压机从这种薄片中切出干胶片。切制一种较大直径的干胶片(直径18mm，重1.5mg)用于体外研究。
在一种试验中，用移液管移液0.24ml或0.40ml的含PDGF的这种胶原溶液到每片干胶片上面。在另一种试验中，把这种干胶片浸泡在一种胶原溶液中。如下制备含PDGF的这种胶原溶液。首先，在30-50℃溶解2g的一种可溶性胶原(Semex S Semex，Frazer，Pennsylvamia)于50ml的蒸馏水中制备一种4%的胶原溶液。把0.13ml的甘油，2ml的乙醇，和2ml的一种PDGF溶液(2mg/ml乙酸盐缓冲剂)加入16ml的所得到的溶液。另外，又把微量的125I-PDGF加入这种溶液。在每片干胶片吸收了该溶液后，过夜干燥这种干胶片就制得了一种含PDGF的海绵胶原体系。
实施例2胶原海绵的释放动力学使用Coster Transwell细胞(“细胞”)(Costar CO.，Cambridge，Massachusetts)按下述研究胶原海绵中活性成分的释放率。如实施例1中所描述的制备125I-PDGF的胶原海绵，并从该薄膜中切得干胶片(1.6cm直径)每个干胶片被转移到一个Coster Transwell细胞并放在聚碳酸酯膜上面。把2.5ml的接收溶液(水和1%牛血清白蛋白，或者水和0.25%人血清白蛋白)加到该细胞容器。该细胞放置在这种接收液上并开始该释放试验。在特定时间，移出20μl该接收液并将相同量的新鲜溶液替换进该接收液中。重复这种取样步骤得到另外20μl试样。用一台γ计数器(Beckman Instruments，CO.，Irvine，California)测出试样的放射性。以该放射性为根据计算在任一给定时间的接受液中的蛋白质浓度并用其它方法如ELISA和3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取生物测定法证实。图1和2和4和5显示了从该干胶片中释放PDGF的典型分布图。从干明胶体系(图1和2)中的释放分布图与该明胶海绵吸收该胶原溶液后马上进行的释放试验的湿明胶系(图4和5)是极其相似的。在100小时释放了大约80%的生长因子。图3和6显示的数据表明干燥过程没有改变该生长因子的活性。
图7显示了从一种无胶原的明胶海绵中PDGF的释放。在这个研究中进行了PDGF从明胶海绵的释放。当把这种膜(厚1cm)浸泡于PDGF溶液中时为除去捕获在该膜内的气泡，把这种膜浸泡在减压的水中。浸过水的膜在PDGF溶液中平衡。用125I-PDGF和Costar Transwell细胞测出PDGF的释放率。该释放率很快。大部分PDGF在12小时内被释放完。从该试验得出的结果表明胶原-明胶海绵体系在一段延长的时间内提供了治疗剂的稳定、连续并持久的释放。
实施例3从胶原-海绵体系中蛋白质体内释放率的测定。
A手术前准备给每只称量约3.0到3.5kg的年轻成熟的新西兰白兔(M和K Rabbitry，Bertonville，Arkansas)用一种镇静药Rompum
(Farbenfabriken，Bayer，西德)麻醉，接着(10分钟后)把氯胺酮(60mg/kg)和甲苯噻嗪(xylaine)(5mg/kg)二者均肌肉内给药。测出每只兔重并记录。把一种小棉或纱布塞插入每只兔的两只耳朵中，之后用一把动物剪刀(＃40刀口)削去两只耳朵的内表面和外边薄薄一层。然后给每只耳朵内表面涂商业上可得到的Neet
脱毛霜10分钟，此后用干纱布除去。耳朵内表面用生理盐水浸泡过的纱布擦净然后涂70%酒精溶液。每只兔的一个耳朵内表面真皮通过用一只30号针将含1∶1000肾上腺素的2%赛鲁卡因溶液(这要求1.5到3.0mls总量)浸润这只耳朵而使其变白。然后把浸润区用3次聚乙烯吡咯酮碘，接着用70%酒精溶液擦净。必要时在该处用干燥塞子替换耳塞。
然后把这些兔子移入无菌手术室。把已变白的耳朵固定在一个耐热有机玻璃“耳板”上(WashingtonUnivevsityMedicalCenter，DivisionofTechnicalServices，St.Louis，Missouri)，它使用了一个双臂钳，一个臂在动物耳朵顶部，另一个在底部，在没有损害耳朵供血条件下稳定兔耳。盖好动物，用聚乙烯吡咯酮碘喷洒手术区(即，变白了的耳朵内表面)并让它干燥3到5分钟。
B、损伤整个损伤步骤使用无菌技术。使用显微手术仪器，一个6mm环锯，和一台双目显微镜(10X，Zeiss)，用一个6mm活检钻给每只兔的内耳表面轻微刻痕，并用显微手术钳，腱切断术剪，一把钝边2mm的Lempert骨膜起子和无菌棉球涂药器在活检部位清除所有的组织和纤维(包括骨膜)到暴露出软骨程度。用解剖法去软骨膜和覆在上面的组织。为实验目的并不需要用钻完全凿穿该软骨，不过，该软骨的部分厚度刻痕被认为是可接受的。仔细注意和记录该软骨上任一切口或自然孔的位置(在收集的那天作为参考)。用无菌棉球涂药器除去活检部位的血，注意照着避免伤口有过多的血。用一小片生理盐水浸过的纱布盖在每个结束了的活检部位。在每只损伤的耳朵每面的中线(当耳朵固定在该板上用对折法确定)上形成四个活动性6mm活检溃疡，不管怎样，每只耳朵上总数不超过5个活检位置。这些活检位置最小间隔1cm。
一只耳朵手术一结束就马上用生理盐水弄湿的纱布覆盖，然后在该纱布周围用带子捆扎封闭以保持湿度一直到使用PDGF。然后用如第一只耳朵的方法把第二只耳朵褪色，擦净，固定并损伤。除去第二只耳朵的每个活检部位的血并用一小片生理盐水浸泡过的纱布覆盖每个完成手术的活检位。第二只耳朵手术一结束马上用生理盐水弄湿的纱布覆盖直到使用PDGF为止。任何兔子在这之前的任一时间显出从麻醉中苏醒的迹象时，用25mg/kg氯胺酮肌肉内给药重新麻醉。
C、给伤口使用活性成分按实施例I的方法制备的干胶片用于体内药物释放研究。小干胶片(直径5mm)用于这个试验。把每片干胶片插入一个伤口部位(直径6mm)并用一片Tagaderm
确保该干胶片保留在伤口部位。
在操作手术的研究者的观察下使兔子从麻醉中苏醒。一苏醒，就把一种大15到25cm的塑料颈圈(CanineCenter，St.Louis，Missouri)套在每只兔颈上防止兔使伤口或敷料破裂。把这些兔子放回一种隔离的笼中，饲养它们直到收集为止。
D、从胶原-明胶海绵体系中释放蛋白质的测定在选择的时间，把好几片干胶片从伤口部位取出。把新的几片Tagaderm
用于覆盖已除去干胶片的伤口部位。将这种干胶片收集在在试验管中。当收集了所有干胶片时，计算每个干胶片的放射性。从剩余干胶片的放射性中计算出在给定时间所释放出的PDGF量。图8表示了从用1%胶原溶液制备的该胶原-明胶海绵体系中PDGF的释放分布图。在49小时后，约62%的PDGF已被释放。图9表示了从用8%胶原溶液制备的该胶原-明胶海绵体系中PDGF的释放分布图。这种溶液是在60℃把可溶性胶原溶于蒸馏水中制得的。在49小时后约73%的PDGF已被释放。
实施例4用鼠血管丛模型测定含胶原海绵对新组织生长的作用在30只Lewis鼠(125-150g)上，从踝到腹股沟韧带解剖左胫骨后部和其母体股骨的动脉-静脉丛。把该丛夹于直径为1.6cm的两胶原片间并放入一个匙状硅化橡胶模型中。A组的片是以胶原-明胶海绵系为基础。在这组中每个片含大约125μg的PDGF。B组中的片是以可溶性胶原为基础的，这组中的每片含约125μg的PDGF。C组中的片是由不含任何PDGF的可溶性胶原组成的，并因此用作对照。在第30天杀死所有的动物。大体上测定这种模型的含量，并用一台数字化计算机和3-D重显影。按组织形状测量学的方法测定所生长的组织体积。
图10表示了三个不同组的新组织体积的生长。在用含125μg的PDGF的胶原-明胶海绵系治疗的动物中观察到新组织体积的实质性增加。在给相同动物模型使用一种可溶性胶原系的前述试验中，发现在植入后10天和15天之间以含PDGF的可溶性胶原为基础的干胶片显著增加新组织的体积。用高剂量PDGF(120μg/胶片)时尤其明显。该试验也表明，植入后30天这种新组织退化。这些实验证明这种胶原-明胶海绵系很好地使新组织体积再生长和/或维持几周。
权利要求
1.一种含有胶原的海绵，包括一种吸收性明胶海绵，胶原和一种活性成分。
2.按照权利要求1的含有胶原的海绵，其中所说的吸收性明胶海绵是一种交联明胶。
3.按照权利要求2的含有胶原的海绵，其中所说的交联明胶是明胶海绵。
4.按照权利要求3的含有胶原的海绵，还可以含有一种增塑剂。
5.按照权利要求4的含有胶原的海绵，其中所说的增塑剂是选自于聚乙二醇和甘油。
6.按照权利要求4的含有胶原的海绵，还可以含有一种稳定剂。
7.按照权利要求6的含有胶原的海绵，其中所说的稳定剂是一种选自于甘露醇、乳糖和葡萄糖一组的糖。
8.按照权利要求6的含有胶原的海绵，还可以包含一种干燥增强剂。
9.按照权利要求8的含有胶原的海绵，其中所说的干燥增强剂是一种选自于乙醇、甲醇和异丙醇一组的醇。
10.按照权利要求8的含有胶原的海绵，还可以包含一种缓冲剂。
11.按照权利要求1的含有胶原的海绵，其中所说的活性成分是选自于由PDGF，EGF，FGF，PDEGF，PD-ECGF，KGF，IGF-1，IGF-2，TNF，BDNF，CNTF和NT-3组成的一组成份。
12.按照权利要求10的含有胶原的海绵，其中所说的活性成分是选自于由PDGF，EGF，FGF，PDEGF，PD-ECGF，KGF，IGF-1，IGF-2，TNF，BDNF，CNTF和NT-3组成的一组成份。
13.按照权利要求11的含有胶原的海绵，其中所说的活性成分是PDGF。
14.按照权利要求12的含有胶原的海绵，其中所说的活性成分是PDGF。
15.一种促进表皮伤口愈合的方法，包括借助权利要求1的胶原海绵使用一种伤口愈合有效剂量的活性成分。
16.一种促进表皮伤口愈合的方法，包括借助权利要求10的胶原海绵使用一种伤口愈合有效剂量的活性成分。
17.一种促进内部伤口愈合的方法，包括借助权利要求1的胶原海绵使用一种伤口愈合有效剂量的活性成分。
18.一种促进内部伤口愈合的方法，包括借助权利要求10的胶原海绵使用一种伤口愈合有效剂量的活性成分。
全文摘要
本发明公开了包含一种吸收性明胶海绵、胶原和一种活性成分的一种含胶原海绵，也公开了如果内部和外部伤口使用这种海绵，促进伤口愈合的方法。
文档编号A61L15/22GK1083392SQ9310634
公开日1994年3月9日 申请日期1993年5月1日 优先权日1992年5月1日
发明者S·Z·宋, A·莫拉韦基 申请人:安姆根有限公司