专利名称：内毒素协同吸附剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医用内毒素协同吸附剂及其制备方法，特别是血液灌流用内毒素协同吸附剂及其制备方法。
背景技术：
内毒素是革兰氏阴性菌生长时释放或死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖类物质，极微量(纳克级)内毒素进入人体就会引起高热，血管扩张，甚至昏厥或死亡。内毒素血症是由于革兰氏阴性菌外细胞壁上的内毒素释放到血液中引起的，可出现于多种疾病过程中，如大面积烧伤、重症肝炎、肝硬化等疾病。内毒素血症是临床最常见的致死疾病之一，其使机体免疫功能严重受损，并能引起休克、弥漫性血管内凝血、多器官功能衰竭等一系列严重的病理变化，最终导致器官坏死、不可逆休克和死亡。死亡率可达40% -90%。临床上尚无有效治疗内毒素血症的方法，已有的方法之一是通过键合有多粘菌素 B的吸附剂进行血液灌流。多粘菌素B是由10个氨基酸组成的多肽类抗生素，可以灭活ET 并具有抗革兰氏阴性菌的作用。如，200510046452. 4号中国发明专利申请公开一种用于血液灌流的内毒素吸附剂的制备方法，通过生物相容性好的球形琼脂糖凝胶为基质，采用环氧氯丙烷、己二胺、1，I’ -羰基二咪唑活化后，键合多粘菌素B配基后，经NaBH4还原，即得到内毒素协同吸附剂。通过该方法制备的吸附剂多粘菌素B固载量6. 12毫克/克吸附剂， 内毒素吸附量达22纳克/克吸附剂。还有使用其它带正电荷的季铵盐、氨基酸或聚合物做配基的研究。贾凌云等在琼脂糖上接枝季铵盐，对血液中内毒素清除率可达50% (CN200710012501. I)。以固定赖氨酸的琼脂糖载体为吸附剂，吸附蛋白质溶液中的内毒素，对蛋白无明显吸附。采用大孔纤维素球载体，固定聚乙烯亚胺，血液灌流吸附内毒素，亦可使内毒素显著下降。但是，上述不论是固载多粘菌素B的吸附剂，还是使用其它带正电荷的季铵盐、氨基酸或聚合物做配基的吸附剂，它们通常只对低浓度下游离的内毒素具有良好的吸附能力。但由于血液中的内毒素形态复杂，大多数情况以聚集状态存在，上述吸附剂对高浓度下处于聚集态的内毒素分子吸附效果并不理想，因此不能有效去除血液中的内毒素。Johoson等人曾用脱氧胆酸配基进行研究。如在聚乙烯载体上，用二胺做手臂，接枝脱氧胆酸，虽然可以吸附除去血液中的内毒素，但吸附量极其有限。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种对内毒素吸附能力更大，去除更彻底的内毒素吸附剂。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为内毒素协同吸附剂，包括多孔的载体和固载在所述载体上的配基，其中，所述配基至少包括脱氧胆酸配基和氨基化合物配基。优选的方案是所固载的脱氧胆酸和氨基化合物的摩尔比为O. 05 1-20 I。
更优选的方案是脱氧胆酸的固载量为O. lumol-50umol/g吸附剂。上述技术方案在多孔载体上同时固载脱氧胆酸和氨基化合物两种配基，利用脱氧胆酸使内毒素解离，同时利用氨基化合物对解离后的内毒素进行吸附除掉。上述吸附剂通过载体上两种配基的协同作用，使其对内毒素的吸附能力远高于带有单一配基的内毒素吸附剂。本发明要解决的另一技术问题是提供一种制备内毒素协同吸附剂的方法，该内毒素协同吸附剂的载体上同时固载有脱氧胆酸和氨基化合物两种配基。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为制备内毒素协同吸附剂的方法， 包括多孔的载体和固载在所述载体上的配基，其中所述配基至少包括脱氧胆酸配基和氨基化合物配基，所述方法包括以下步骤步骤一准备多孔载体；步骤二 在多孔载体上固载脱氧胆酸；步骤三在已固载了脱氧胆酸的多孔载体上再固载氨基化合物。优选的方案为步骤二包括以下步骤步骤2. I :对载体的进行环氧活化；步骤2. 2 :对己环氧活化的载体进行氨化；步骤2. 3 :在已经氨化的载体上固载脱氧胆酸。另一优选的方案为步骤二包括以下步骤步骤2. I对载体的进行环氧活化按体积份，在5-15份载体中加入5-10份浓度为1_3M的氢氧化钠溶液和10_20份一端带活性基团，一端带环氧基的环氧化合物，在30-60°C搅拌反应l_5h，然后依次用水和 50% -95%的乙醇溶液洗涤载体5-10次，获得环氧活化的载体； 步骤2. 2对己环氧活化的载体进行氨化向步骤2. I所获得的已经过环氧活化的载体中加入10_20mL氨水，在30_60°C搅拌反l_5h，将氨基接在载体上；步骤2. 3在已经氨化的载体上固载脱氧胆酸将脱氧胆酸钠溶于40%的二甲亚砜水溶液，配制成浓度为l-5mmol/L的脱氧胆酸钠溶液；按体积份，取200-400份所述脱氧胆酸钠溶液，加入氨化后的载体5-15份，搅拌， 用O. 2-0. 4M的HCl调节体系pH值至4_6，向体系中缓慢加入5_10mM I-环己基_2_(吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐的二甲亚砜水溶液，其中所述载体的体积与所述I-环己基-2-(吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐的二甲亚砜水溶液的体积比为I : 2，搅拌反应l_5h，反应过程中滴加O. 2-0. 4M的HCl，使体系pH值保持在4_6 ;反应完成反后用95 % 乙醇溶液洗涤，除去未反应的脱氧胆酸钠。更优选的方案为步骤三包括如下步骤步骤3. I对步骤二所获得的已固载有脱氧胆酸的载体进行二次活化；步骤3. 2向步骤3. I所获得的已固载有脱氧胆酸的载体上固载氨基化合物。通过上述方法制备的内毒素协同吸附剂，载体上同时固载有脱氧胆酸和氨基化合物两种配基，对内毒素的吸附能力远远大于单一配基的内毒素协同吸附剂。本发明内毒素协同吸附剂的载体的平均粒径为50um_1500um，更好的为 300um-800um，籍此，本发明内毒素协同吸附剂不但可具有良好的吸附率，且可以用于全血吸附。本发明载体的孔径范围可以为2nm-300nm,优选IOnm-IOOnm, —方面可保证具有较大的比表面积，另一方面又较适合内毒素的吸附。本发明内毒素协同吸附剂的载体可以是纤维素、琼脂糖、聚乙烯醇、苯乙烯-二乙烯苯共聚物或者聚甲基丙烯酸甲酯，优选纤维素、聚甲基丙烯酸，更优选的载体为纤维素载体。因为纤维素载体具有以下优点(I)相对高的机械强度和韧性，可以满足全血灌流的要求。(2)具有良好的生物相容性，安全性好。(3)来源丰富，成本低廉。(4)环境友好，使用后可以自然降解。本发明内毒素的载体可以是商业途径购买，也可以是自己制备。例如，可通过将添加一定比例的致孔剂的醋酸纤维素溶液分散在聚乙烯醇(PVA)水溶液中，待分散到合适粒径后，加热固化成球，制备出粒径孔径符合要求的二醋酸纤维素载体。关于载体的制备，现有技术中已有很多方法，为节省起见，此处不再赘述。在本发明中，考虑到脱氧胆酸在化学性质上更稳定，不宜受后续化学过程的影响， 因此采用首先固载脱氧胆酸，然后再固载阳离子化合物的方法。综合考虑到成本及吸附效果等因素，本发明内毒素协同吸附剂上固载的脱氧胆酸的量优选为O. lumol-50umol/g吸附剂,更优选O. 5umol-20umol/g吸附剂。脱氧胆酸配基的量太少，吸附剂对聚集内毒素的解离能力有限。在一定量氨基化合物配基的量下，脱氧胆酸配基的量达到某一平台值之后，再增加脱氧胆酸量，内毒素的吸附能力也不会有太大的提高，而成本将会更高。本发明中，可以采用肽偶联共价结合脱氧胆酸的方法固定脱氧胆酸，如将带有羟基的载体与一端带有活性基团，另一端带有环氧基团的化合物进行环氧活化反应，再用氨水氨化，引入氨基，然后通过肽偶联的方法接枝脱氧胆酸。其中，一端带有活性基团，另一端带有环氧基团的化合物可以是环氧氯丙烷或带双环氧基团的化合物等。在本发明内毒素协同吸附剂上的氨基化合物是含有氨基的化合物，可以是氨基酸或者聚氨基酸，如多粘菌素B(PMX-B)、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或者聚赖氨酸等，优选 PMX-B。氨基化合物的正电荷可以相对特异性地吸附表面带有磷酸根基团的内毒素分子。 本发明中内毒素协同吸附剂上的氨基化合物可以采用环氧基或醛基和氨基反应的方法固载，优选环氧基反应。综合考虑成本及吸附效果等因素，本发明内毒素协同吸附剂上固载的氨基化合物的量优选为O. lumol-100umol/g吸附剂,更优选的为lumol-10umol/g吸附剂。 考虑到在通过肽偶联的方法接枝脱氧胆酸后载体上可能还残留大量的氨基，可选择使用二醛或者双环氧化合物，通过醛基和氨基之间的反应，去除氨基，完成阳离子化合物的接枝。 其中二醛可以是戊二醛或己二醛，优选戊二醛。双环氧可以是1，3_丙二醇缩水甘油醚、1， 4-丁二醇缩水甘油醚或1，5_戊二醇缩水甘油醚，优选1，4_ 丁二醇缩水甘油醚。本发明内毒素协同吸附剂上所固载的两种配基的比例对吸附的效果和成本有一定的影响，优选的，脱氧胆酸和氨基化合物摩尔比在0.05 1-20 I之间，优选 0.1 1-10 I之间，更优选0.5 1-1 3之间。其中脱氧胆酸的量不能太少，否则吸附剂对聚集内毒素的解离能力有限，影响吸附能力。脱氧胆酸配基量过多也没有积极的作用， 在一定量PMX-B配基量下，在某一平台值之后，再增加脱氧胆酸量，不会增加对内毒素的吸附能力。过量的氨基化合物，如PMX-B具有神经毒性和肾毒性。因此，氨基化合物的固载量也不能太高，最好控制在20mg/mL吸附剂以下。
具体实施例方式实施例I
本实施例内毒素协同吸附剂的制备方法如下步骤一制备大孔纤维素载体将12g 二醋酸纤维素溶解在由SOmL 二氯甲烷和20mL乙醇组成的混合溶剂中，纤维素溶液的质量分数为9%。向上述溶液中加入乙酸乙酯IOOmL,作为致孔剂，混合均匀。配制400mL5%的PVA 水溶液作为分散相。将纤维素溶液缓慢倾入装有分散相中，控制搅拌速度为100-160r. p. m, 使纤维素溶液充分分散成均匀的小液滴，然后保持搅拌速度，加热至35°C,使二氯甲烷完全挥发，纤维素颗粒彻底固化。用水和75%乙醇洗涤彻底除去PVA和致孔剂，得到孔径范围为 50-200nm的纤维素载体。步骤二 在步骤一所制备的多孔载体上固载脱氧胆酸步骤2. I载体的环氧活化向IOmL载体中加入6mL 3M的氢氧化钠溶液和15mL环氧氯丙烷，在50°C搅拌反 2h。依次用水和乙醇洗涤载体,获得环氧活化的载体。步骤2. 2载体的氨化向步骤2. I所获得的己环氧活化的载体中加入20mL氨水，在50°C搅拌反2h，将氨基接在载体上。步骤2. 3在载体上固载脱氧胆酸(DOC)将Immol脱氧胆酸钠溶液溶于300mL 40%的二甲亚砜水溶液。加入氨化后的载体 10mL，搅拌，用O. 3M的HCl调节体系pH值至4. 8。向体系中缓慢加入6mM I-环己基_2_(吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(WCCM)的二甲亚砜水溶液(载体和二甲亚砜水溶液的体积比为1:2)。搅拌反应3h，过程中滴加O. 3M的HC1，使体系pH值保持在4. 8。反应完成后用乙醇洗涤，除去未反应的脱氧胆酸钠。步骤三在已固载了脱氧胆酸的多孔载体上再固载氨基化合物步骤3. I对步骤二所获得的已固载有脱氧胆酸的载体进行二次活化固载DOC后的载体上仍有很多残留的氨基。向IOmL该载体中加入IOmL的1，4_ 丁二醇-二缩水甘油醚和O. IM的氢氧化钠溶液15mL在室温下搅拌反应18h。反应后用水冲洗干净。步骤3. 2向步骤3. I所获得的已固载有脱氧胆酸的载体上固载多粘菌素B将O. Ig多粘菌素B溶于IOmL水中，用氢氧化钠溶液将pH值调至11，加入由步骤 3. I所获得的载体5mL，室温反应2h，然后用IM的氯化钠冲洗，获得以大孔纤维素为载体，含有脱氧胆酸和多粘菌素B配基的内毒素协同吸附剂。实施例2本实施例内毒素协同吸附剂的制备过程如下步骤一制备大孔纤维素载体该步骤与实施例I相同，不再赘述。步骤二 在步骤一所制备的多孔载体上固载脱氧胆酸步骤2. I载体的环氧活化向IOmL载体中加入6mL 3M的氢氧化钠溶液和15mL环氧氯丙烷，在50°C搅拌反 2h。依次用水和乙醇洗涤载体,获得环氧活化的载体。
步骤2. 2载体的氨化向步骤2. I所获得的己环氧活化的载体中加入20mL氨水，在50°C搅拌反2h，将氨基接在载体上。步骤2. 3在载体上固载脱氧胆酸(DOC)将Immol脱氧胆酸钠溶于300mL 40%的二甲亚砜水溶液。加入氨化后的载体 10mL，搅拌，用O. 3M的HCl调节体系pH值至4. 8。向体系中缓慢加入6mM I-环己基_2_(吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(WCCM)的二甲亚砜水溶液(体积比为1:2)。搅拌反应3h，过程中滴加O. 3M的HC1，使体系pH值保持在4. 8。反应完成后用乙醇洗涤，除去未反应的脱氧胆酸钠。步骤三在已固载了脱氧胆酸的多孔载体上再固载氨基化合物步骤3. I对步骤二所获得的已固载有脱氧胆酸的载体进行二次活化固载DOC后的载体上仍有很多残留的氨基。向IOmL该载体中加入25mL O. 05M pH 为7. 4的磷酸缓冲溶液，在搅拌条件下滴加8mL 25%的戊二醛，在室温下搅拌反应2h。(醛基含量约为74umol/g)。反应后用O. IM的磷酸缓冲液和水冲洗。步骤3. 2向步骤3. I所获得的已固载有脱氧胆酸的载体上固载多粘菌素B将O. Ig多粘菌素B溶于IOmL水中，用氢氧化钠溶液将pH值调至11，加入二次活化后的载体5mL，室温反应2h，然后用IM的氯化钠冲洗。用硼氢化钠还原双键，水洗至中性。 获得以大孔纤维素为载体，含有脱氧胆酸和多粘菌素B配基的内毒素协同吸附剂。实施例3本实施例内毒素协同吸附剂的制备过程如下步骤一制备大孔纤维素载体该步骤与实施例I相同，不再赘述。步骤二 在步骤一所制备的多孔载体上固载脱氧胆酸步骤2. I载体的环氧活化向IOmL载体中加入6mL 3M的氢氧化钠溶液和15mL环氧氯丙烷，在50°C搅拌反 2h。依次用水和乙醇洗涤载体,获得环氧活化的载体。步骤I. 2载体的氨化向步骤2. I所获得的己环氧活化的载体中加入20mL氨水，在50°C搅拌反2h，将氨基接在载体上。步骤2. 3在载体上固载脱氧胆酸(DOC)将Immol脱氧胆酸钠溶于300mL 40%的二甲亚砜水溶液。加入氨化后的载体 10mL，搅拌，用O. 3M的HCl调节体系pH值至4. 8。向体系中缓慢加入6mM I-环己基_2_(吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(WCCM)的二甲亚砜水溶液(体积比为1:2)。搅拌反应3h，过程中滴加O. 3M的HC1，使体系pH值保持在4. 8。反应完成后用乙醇洗涤，除去未反应的脱氧胆酸钠。步骤三在已固载了脱氧胆酸的多孔载体上再固载氨基化合物步骤3. I对步骤二所获得的已固载有脱氧胆酸的载体进行二次活化固载DOC后的载体上仍有很多残留的氨基。向IOmL该载体中加入25mL O. 05M pH 为7. 4的磷酸缓冲溶液，在搅拌条件下滴加8mL 25%的戊二醛，在室温下搅拌反应2h。(醛基含量约为74umol/g)。反应后用O. IM的磷酸缓冲液和水冲洗。步骤3. 2向步骤3. I所获得的已固载有脱氧胆酸的载体上固载赖氨酸将O. 2g赖氨酸溶于IOmL水中,用氢氧化钠将溶液溶液调至碱性,加入二次活化后的载体5mL，室温反应2h，然后用IM的氯化钠冲洗。用硼氢化钠还原双键，水洗至中性。获得以大孔纤维素为载体，含有脱氧胆酸和赖氨酸的内毒素协同吸附剂。实施例4本实施例内毒素协同吸附剂的制备过程如下步骤一制备大孔纤维素载体该步骤与实施例I相同，不再赘述。步骤二 在步骤一所制备的多孔载体上固载脱氧胆酸步骤2. I载体的环氧活化向IOmL载体中加入6mL 3M的氢氧化钠溶液和15mL环氧氯丙烷，在50°C搅拌反 2h。依次用水和乙醇洗涤载体,获得环氧活化的载体。步骤2. 2载体的氨化向步骤2. I所获得的己环氧活化的载体中加入20mL氨水，在50°C搅拌反此，将氨基接在载体上。步骤2. 3在载体上固载脱氧胆酸(DOC)将Immol脱氧胆酸钠溶于300mL 40%的二甲亚砜水溶液。加入氨化后的载体 10mL，搅拌，用O. 3M的HCl调节体系pH值至4. 8。向体系中缓慢加入6mM I-环己基_2_(吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(WCCM)的二甲亚砜水溶液(体积比为1:2)。搅拌反应3h，过程中滴加O. 3M的HC1，使体系pH值保持在4. 8。反应完成后用乙醇洗涤，除去未反应的脱氧胆酸钠。步骤三在已固载了脱氧胆酸的多孔载体上再固载氨基化合物步骤3. I对步骤二所获得的已固载有脱氧胆酸的载体进行二次活化固载DOC后的载体上仍有很多残留的氨基。向IOmL该载体中加入25mL O. 05M pH 为7. 4的磷酸缓冲溶液，在搅拌条件下滴加8mL 25%的戊二醛，在室温下搅拌反应2h。(醛基含量约为74umol/g)。反应后用O. IM的磷酸缓冲液和水冲洗。步骤3. 2向步骤3. I所获得的已固载有脱氧胆酸的载体上固载精氨酸将O. 2g精氨酸溶于IOmL水中，用氢氧化钠将溶液溶液调至碱性，加入二次活化后的载体5mL，室温反应2h，然后用IM的氯化钠冲洗。用硼氢化钠还原双键，水洗至中性。获得以大孔纤维素为载体，含有脱氧胆酸和精氨酸的内毒素协同吸附剂。实施例5 本实施例内毒素协同吸附剂的制备过程如下步骤一制备大孔纤维素载体该步骤与实施例I相同，不再赘述。步骤二 在步骤一所制备的多孔载体上固载脱氧胆酸步骤2. I载体的环氧活化向IOmL载体中加入6mL 3M的氢氧化钠溶液和15mL环氧氯丙烷，在50°C搅拌反 2h。依次用水和乙醇洗涤载体,获得环氧活化的载体。
步骤2. 2载体的氨化向环氧活化的载体中加入20mL氨水，在50°C搅拌反2h，将氨基接在载体上。步骤2. 3在载体上固载脱氧胆酸(DOC)将O. 5mmol脱氧胆酸钠溶于300mL 40%的二甲亚砜水溶液。加入氨化后的载体 10mL，搅拌，用O. 3M的HCl调节体系pH值至4. 8。向体系中缓慢加入6mM I-环己基_2_(吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(WCCM)的二甲亚砜水溶液(体积比为1:2)。搅拌反应3h，过程中滴加O. 3M的HC1，使体系pH值保持在4. 8。反应完成后用乙醇洗涤，除去未反应的脱氧胆酸钠。步骤三在已固载了脱氧胆酸的多孔载体上再固载氨基化合物步骤3. I对步骤二所获得的已固载有脱氧胆酸的载体进行去氨基固载DOC后的载体上仍有很多残留的氨基。向IOmL该载体中加入25mL O. 05M pH 为7. 4的磷酸缓冲溶液，在搅拌条件下滴加8mL 25%的戊二醛，在室温下搅拌反应2h。(醛基含量约为74umol/g)。反应后用O. IM的磷酸缓冲液和水冲洗。步骤3. 2向步骤3. I所获得的已固载有脱氧胆酸的载体上固载多粘菌素B将O. Ig多粘菌素B溶于IOmL水中，用氢氧化钠溶液将pH值调至11，加入二次活化后的载体5mL，室温反应2h，然后用IM的氯化钠冲洗。比较例I按以下步骤制备吸附剂步骤一制备载体，方法同实施例I。步骤二 固载多粘菌素B步骤2. I载体的环氧活化向IOmL载体中加入6mL 3M的氢氧化钠溶液和15mL环氧氯丙烷，在50°C搅拌反应 2h。依次用水和乙醇洗涤载体三次以上，获得环氧活化的载体。步骤2· 2PMX-B的固载将O. Ig多粘菌素B溶于IOmL水中，用氢氧化钠溶液将pH值调至11，加入环氧活化后的载体5mL，室温反应2h，然后用IM的氯化钠冲洗，获得固载有多粘菌素B的吸附剂。比较例2:按以下步骤制备吸附剂步骤一制备载体，方法同实施例I。步骤二 固载多粘菌素B步骤2. I载体的环氧活化向IOmL载体中加入6mL 3M的氢氧化钠溶液和15mL环氧氯丙烷，在50°C搅拌反应 2h。依次用水和乙醇洗涤载体三次以上，获得环氧活化的载体。步骤2· 2PMX-B的固载将O. 3g多粘菌素B溶于IOmL水中，用氢氧化钠溶液将pH值调至11，加入一次活化后的载体5mL，室温反应2h，然后用IM的氯化钠冲洗。获得固载有多粘菌素B的吸附剂。比较例3:按以下步骤制备吸附剂步骤一制备载体，方法同实施例I。
步骤二 固载多粘菌素B步骤2. I载体的环氧活化向IOmL载体中加入6mL 3M的氢氧化钠溶液和15mL环氧氯丙烷，在50°C搅拌反应 2h。依次用水和乙醇洗涤载体三次以上，获得环氧活化的载体。步骤2· 2PMX-B的固载将O. 2g多粘菌素B溶于IOmL水中，用氢氧化钠溶液将pH值调至11，加入一次活化后的载体5mL，室温反应2h，然后用IM的氯化钠冲洗。获得固载有多粘菌素B的吸附剂。比较例4:按以下步骤制备吸附剂步骤一制备载体，方法同实施例I。步骤二 固载多粘菌素B步骤2. I载体的环氧活化向IOmL载体中加入6mL 3M的氢氧化钠溶液和15mL环氧氯丙烷，在50°C搅拌反 2h。依次用水和乙醇洗涤载体,获得环氧活化的载体。步骤2. 2载体的氨化向环氧活化的载体中加入20mL氨水，在50°C搅拌反2h，将氨基接在载体上，完成一次活化步骤2. 3在载体上固载脱氧胆酸(DOC)将Immo I脱氧胆酸钠溶于300mL 40%的二甲亚砜水溶液。加入氨化后的载体 10mL，搅拌，用O. 3M的HCl调节体系pH值至4. 8。向体系中缓慢加入6mM I-环己基_2_(吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(WCCM)的二甲亚砜水溶液(体积比为1:2)。搅拌反应3h，过程中滴加O. 3M的HC1，使体系pH值保持在4. 8。反应完成后用乙醇洗涤，除去未反应的脱氧胆酸钠，获得固载有脱氧胆酸的吸附剂。比较例5:按以下步骤制备吸附剂步骤一制备载体，方法同实施例I。步骤二 固载多粘菌素B步骤2. I载体的环氧活化向IOmL载体中加入6mL 3M的氢氧化钠溶液和15mL环氧氯丙烷，在50°C搅拌反 2h。依次用水和乙醇洗涤载体,获得环氧活化的载体。步骤2. 2载体的氨化向环氧活化的载体中加入20mL氨水，在50°C搅拌反2h，将氨基接在载体上，完成一次活化步骤2. 3在载体上固载脱氧胆酸(DOC)将2mmol脱氧胆酸钠溶于300mL 40%的二甲亚砜水溶液。加入氨化后的载体 10mL，搅拌，用O. 3M的HCl调节体系pH值至4. 8。向体系中缓慢加入6mM I-环己基_2_(吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(WCCM)的二甲亚砜水溶液(体积比为1:2)。搅拌反应6h，过程中滴加O. 3M的HC1，使体系pH值保持在4. 8。反应完成后用乙醇洗涤，除去未反应的脱氧胆酸钠。获得固载有脱氧胆酸的吸附剂。
性能评价I、配基固载量的检测吸附剂上DOC的含量可通过脱氧胆酸试剂盒(sigma)检测。对实施例I至3,对比例1-5的吸附剂固载脱氧胆酸的量的检测结果具体见表一。氨基化合物为氨基酸或者氨基酸组成的多肽，可以通过茚三酮法检测。茚三酮和 a氨基反应生成蓝紫色的化合物，不同浓度下该化合物在570nm处的吸光度值不同，可据此绘制成标准曲线。检测特定吸附剂在570nm处的紫外吸光度值，便可根据标准曲线计算
出氨基酸的固载量。称量0. 02g吸附剂，置于25mL比色管中，加水4. OmL，再向各管中加入2%茚三酮溶液和Na2HP04-KH2P04 (pH = 8)缓冲溶液个I. 0毫升，混勻，于80°C反应30分钟，冷却至室温，加水至25mL，混匀，静置lOmin，检测样品管中570nm处的OD.值。按以上方法，分别对实施例I至3，对比例1-5的吸附剂固载多粘菌素B的量进行检测，检测结果见表一。2、吸附能力的检测检测方法如下标准溶液为小牛血清(BSA)溶液外添加内毒素标准品。配制lOmg/mL浓度的BSA 水溶液，添加内毒素标准品至约500Eu/mL。准确称取ImL吸附剂于50mL锥形瓶中，用灭菌注射用水冲洗三次，吸干表面水分， 加入5mL 500Eu/mL的内毒素BSA溶液。将该样品和空白样放入恒温水浴振荡器中，在37°C 吸附2小时。用动态浊度法检测内毒素的水平，计算吸附剂的吸附率。通过以上方法，分别对实施例I至3，对比例1-5的吸附剂对内毒素的吸附能力进行检测，检测结果见表一。表一实施例I至3，对比例1-5吸附剂的配基固载量及吸附能力
样品DOC固载量 (umol/g)PMX-B固载量 (umol/g)内毒素吸附率(％)实施例I3.695.1791实施例23.183.9486实施例33.274.89 (此处配基是赖氨酸)6权利要求
1.内毒素协同吸附剂，包括多孔的载体和固载在所述载体上的配基，其特征在于 所述配基至少包括脱氧胆酸配基和氨基化合物配基。
2.根据权利要求I所述的内毒素协同吸附剂，其特征在于所述脱氧胆酸和所述氨基化合物的摩尔比为O. 05 1-20 I。
3.根据权利要求I或2任一项所述的内毒素协同吸附剂，其特征在于所述脱氧胆酸的固载量为O. lumol-50umol/g吸附剂。
4.根据权利要求3所述的内毒素协同吸附剂，其特征在于所述氨基化合物选自氨基酸或聚氨基酸。
5.根据权利要求3所述的内毒素协同吸附剂，其特征在于所述氨基化合物选自多粘菌素B、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或者聚赖氨酸。
6.制备内毒素协同吸附剂的方法，包括多孔的载体和固载在所述载体上的配基，所述配基至少包括脱氧胆酸配基和氨基化合物配基，其特征在于所述方法包括以下步骤步骤一准备多孔载体；步骤二 在多孔载体上固载脱氧胆酸；步骤三在已固载了脱氧胆酸的多孔载体上再固载氨基化合物。
7.根据权利要求6所述制备内毒素协同吸附剂的方法，其特征在于所述步骤二包括以下步骤步骤2. I :对载体的进行环氧活化；步骤2. 2 :对己环氧活化的载体进行氨化；步骤2. 3 :在已经氨化的载体上固载脱氧胆酸。
8.根据权利要求6所述制备内毒素协同吸附剂的方法，其特征在于所述步骤二包括以下步骤步骤2. I对载体的进行环氧活化按体积份，在5-15份载体中加入5-10份浓度为1-3M的氢氧化钠溶液和10-20份一端带活性基团，一端带环氧基的环氧化合物，在30-60°C搅拌反应l_5h，然后依次用水和 50% -95%的乙醇溶液洗涤载体5-10次，获得环氧活化的载体；步骤2. 2对己环氧活化的载体进行氨化向步骤2. I所获得的已经过环氧活化的载体中加入10-20mL氨水，在30_60°C搅拌反 l_5h，将氨基接在载体上；步骤2. 3在已经氨化的载体上固载脱氧胆酸将脱氧胆酸钠溶于40%的二甲亚砜水溶液，配制成浓度为l-5mmol/L的脱氧胆酸钠溶液；按体积份，取200-400份所述脱氧胆酸钠溶液，加入氨化后的载体5-15份，搅拌，用O.2-0. 4M的HCl调节体系pH值至4_6，向体系中缓慢加入5_10mM I-环己基_2_(吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐的二甲亚砜水溶液，其中所述载体的体积与所述I-环己基-2-(吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐的二甲亚砜水溶液的体积比为I : 2，搅拌反应l_5h，反应过程中滴加O. 2-0. 4M的HCl，使体系pH值保持在4_6 ;反应完成反后用95 % 乙醇溶液洗涤，除去未反应的脱氧胆酸钠。
9.根据权利要求6所述制备内毒素协同吸附剂的方法，其特征在于所述步骤三包括如下步骤步骤3. I对步骤二所获得的已固载有脱氧胆酸的载体进行二次活化；步骤3. 2向步骤3. I所获得的已固载有脱氧胆酸的载体上固载氨基化合物。
10.根据权利要求6至9任一项所述的制备内毒素协同吸附剂的方法，其特征在于所述氨基化合物选自多粘菌素B、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或者聚赖氨酸。
全文摘要
本发明公开一种内毒素协同吸附剂及其制备方法。其中，内毒素协同吸附剂包括多孔的载体和固载在所述载体上的配基，其中，所述配基至少包括脱氧胆酸配基和氨基化合物配基。通过载体上两种配基的协同作用，使吸附剂对内毒素的吸附能力显著增强。
文档编号B01J20/22GK102580683SQ20121002393
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月3日 优先权日2012年2月3日
发明者董凡 申请人:珠海健帆生物科技股份有限公司