] (1)对鲎试剂灵敏度复核：使用厦门市鲎试剂实验厂有限公司生产的鲎试剂盒 (灵敏度A=〇.5EU/ml)和内毒素标准品（10EU/ml)，按厂家说明书进行操作。经测定，该 批鲎试剂灵敏度的测定值在0.5A~2A(包含0.5A及2A)，可用于细菌内毒素检查
[0046] (2)对重组蛋白的稀释和凝胶半定量法测定内毒素含量：按《中华人民共和国药 典》2010版中《细菌内毒素检查法》的"凝胶半定量实验"进行。用细菌内毒素检查用水稀释 供试品，每一支装有0.Iml鲎试剂的安碚瓶中分别加入0.Iml系列稀释的供试品作为试品 管，每个稀释度做2个平行；另取2支加入0.1ml2A内毒素工作标准品作为阳性对照；2支 加入去内毒素水0.Iml作为阴性对照。将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37°C±1°C 的温箱中，保温60±2min(保温过程和拿取试管要小心，避免因受到震动造成阴性结果）。 实验结果如表1~3所不。
[0047] 表1 (第一部分）样品经纯化、300KD和5KD膜包浓缩后，4倍稀释后用凝胶半定量 法测定结果
[0050] 表1(第二部分）样品经纯化、300KD和5KD膜包浓缩后，4倍稀释后用凝胶半定量 法测定结果
[0051]
[0052] 表1中：样品内毒素浓度=XX反应终点浓度=0. 5EU/mlX64 = 32EU/ml
[0053] 供试品内毒素终浓度=32EU/mlX4倍=128EU/ml
[0054] 表2 (第一部分）样品纯化、300KD和5KD膜包浓缩后，用0. 22um滤膜过滤后，4倍 稀释，凝胶半定量法测定结果
[0055]
[0056] 表2 (第二部分）样品纯化、300KD和5KD膜包浓缩后，用0? 22um滤膜过滤后，4倍 稀释，凝胶半定量法测定结果
[0057]
[0058] 表2中：样品内毒素浓度=人X反应终点浓度=0? 5EU/mlX2 =lEU/ml
[0059] 供试品内毒素终浓度=lEU/mlX4倍=4EU/ml
[0060] 表3 (第一部分）样品纯化、5KD膜包浓缩后，4倍稀释后用凝胶半定量法测定结果
[0063] 表3 (第二部分）样品纯化、5KD膜包浓缩后，4倍稀释后用凝胶半定量法测定结果
[0064]
[0065] 表 3 中：G= (0? 03125X0? 0625)1/2= 0? 4419 = 1:22. 6
[0066] 样品内毒素浓度=XX反应终点浓度=0. 5EU/mlX22. 6 = 11. 313EU/ml
[0067] 供试品内毒素终浓度=11. 313EU/mlX4倍=45EU/ml
[0068] 如以上表1~3所示结果，样品纯化后，同时运用300KD和5KD膜包浓缩，用0. 22um 滤膜过滤后，内毒素含量可降低至畜禽临床应用标准范围之内。
[0069] 实施例2
[0070] -种去除蛋白质中内毒素的方法，包括以下步骤：
[0071] 1)对待处理样品进行层析纯化，收集目的蛋白；
[0072] 2)取步骤1)得到的目的蛋白利用超滤膜包进行超滤，收集滤过液，其中膜包进口 压力为l〇psi，回流口压力为4psi;
[0073] 3)取步骤2)产物用0. 22ym孔径的滤膜过滤，收集滤过液。
[0074] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0075] 步骤2)所述膜包中的膜面积与待处理样品总量的比例为0.lft2/L。
[0076] 步骤2)用于超滤的加压栗对每平方英尺膜面积其流量为I. 2L/min。
[0077] 步骤2)收集滤过液后，利用NaOH溶液或H3PO4溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清 洗剂或HenkelP3-11清洗膜包，其中所述NaOH溶液的浓度为0.ImM。
[0078] 步骤2)所述膜包的截留分子量为100D。
[0079] 步骤2)所述膜包的截留分子量为3KD。
[0080] 步骤2)对目的蛋白超滤后，利用缓冲液继续执行超滤3min，收集滤过的缓冲液与 超滤后的目的蛋白混合，而后执行步骤3)。
[0081] 步骤2)所述的超滤为切向流过滤。
[0082] 步骤1)所述的层析是亲和层析或离子交换层析或疏水层析或凝胶过滤层析。
[0083] 实施例3
[0084] -种去除蛋白质中内毒素的方法，包括以下步骤：
[0085] 1)对待处理样品进行层析纯化，收集目的蛋白；
[0086] 2)取步骤1)得到的目的蛋白利用超滤膜包进行超滤，收集滤过液，其中膜包进口 压力为25psi，回流口压力为6psi;
[0087] 3)取步骤2)产物用0. 25ym孔径的滤膜过滤，收集滤过液。
[0088] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0089] 步骤2)所述膜包中的膜面积与待处理样品总量的比例为0. 7ft2/L。
[0090] 步骤2)用于超滤的加压栗对每平方英尺膜面积其流量为2. 5L/min。
[0091] 步骤2)收集滤过液后，利用NaOH溶液或H3PO4溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清 洗剂或HenkelP3-11清洗膜包，其中所述NaOH溶液的浓度为0. 5mM。
[0092] 步骤2)所述膜包的截留分子量为500KD。
[0093] 步骤2)所述膜包的截留分子量为10KD。
[0094] 步骤2)对目的蛋白超滤后，利用缓冲液继续执行超滤5min，收集滤过的缓冲液与 超滤后的目的蛋白混合，而后执行步骤3)。
[0095] 实施例4
[0096] -种去除蛋白质中内毒素的方法，包括以下步骤：
[0097] 1)对待处理样品进行层析纯化，收集目的蛋白；
[0098] 2)取步骤1)得到的目的蛋白利用超滤膜包进行超滤，收集滤过液，其中膜包进口 压力为18psi，回流口压力为5psi;
[0099] 3)取步骤2)产物用0. 22ym孔径的滤膜过滤，收集滤过液。
[0100] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0101] 步骤2)所述膜包中的膜面积与待处理样品总量的比例为0. 4ft2/L。
[0102] 步骤2)用于超滤的加压栗对每平方英尺膜面积其流量为I. 7L/min。
[0103] 步骤2)收集滤过液后，利用NaOH溶液或H3PO4溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清 洗剂或HenkelP3-11清洗膜包。
[0104] 步骤2)所述的超滤为切向流过滤。
[0105] 实施例5
[0106] -种去除蛋白质中内毒素的方法，包括以下步骤：
[0107] 1)对待处理样品进行层析纯化，收集目的蛋白；
[0108] 2)取步骤1)得到的目的蛋白利用超滤膜包进行超滤，收集滤过液，其中膜包进口 压力为22psi，回流口压力为4. 5psi;
[0109] 3)取步骤2)产物用0. 45ym孔径的滤膜过滤，收集滤过液。
[0110] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种去除蛋白质中内毒素的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 对待处理样品进行层析纯化，收集目的蛋白； 2) 取步骤1)得到的目的蛋白利用超滤膜包进行超滤，收集滤过液，其中膜包进口压力 为10~25psi，回流口压力为4~6psi ; 3) 取步骤2)产物用0. 22~0. 45 y m孔径的滤膜过滤，收集滤过液。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述膜包中的膜面积与待处理样品 总量的比例不低于〇. lft2/L。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)用于超滤的加压栗对每平方英尺膜 面积其流量不低于I. 2L/min。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)收集滤过液后，利用NaOH溶液或 氏卩04溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清洗剂或Henkel P3-11清洗膜包。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述NaOH溶液的浓度为0. 1~0. 5mM。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述膜包的截留分子量为100~ 1000 KD07. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述膜包的截留分子量为1~ IOOKD08. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)对目的蛋白超滤后，利用缓冲液继 续执行超滤3~5min，收集滤过的缓冲液与超滤后的目的蛋白混合，而后执行步骤3)。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述的超滤为切向流过滤。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)所述的层析是亲和层析或离子交 换层析或疏水层析或凝胶过滤层析。
【专利摘要】本发明提供了一种去除蛋白质中内毒素的方法，该方法先后结合层析、超滤和普通过滤，符合蛋白纯化的工艺流程，在有效去除内毒素的同时实现蛋白的纯化，且不影响蛋白自身性质，尤其适用于各类基因工程菌表达的胞内、胞外蛋白的处理。此外，本发明通过对过滤模式、过滤压力、膜孔径等条件的优化设计，简化了操作步骤和操作时间，从而降低了生产成本、提升处理量，利用本发明方法可将内毒素含量降低至畜禽临床应用标准范围之内，并且在去除内毒素的同时不影响制品本身的性质，适合规模化生产应用。
【IPC分类】C07K1/34, C07K1/36, C07K1/16
【公开号】CN105001299
【申请号】CN201510412140
【发明人】张英, 吕茂杰, 杨保收, 付旭彬, 梁武
【申请人】天津瑞普生物技术股份有限公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月14日