糖基化多肽及其与载体蛋白的偶联物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种糖基化多肽及其与载体蛋白的偶联物及其制备方法与应用，所述 的糖基化多肽或其与载体蛋白的偶联物能代替昂贵的人糖化血红蛋白抗原纯制品制备层 析试条(试纸条)，该层析试条能快速、精确、定量、简便的检测全血中的糖化血红蛋白。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一组病因和发病机制尚未完全明了的内分泌代谢疾病，目前发病率仅次 于心血管疾病和肿瘤。根据医学杂志《TheNewEnglandJournalofMedicine》2010年3 月报道，我国的糖尿病患者数目已达9200万。目前临床已广泛开展检测患者血糖工作，实 现了医院大型生化分析仪集中监测和患者使用手持式血糖仪家庭式即时检测的立体网络。 但是，血糖测定只是代表即刻的血糖水平，提示患者当时的身体状况，并不能作为评价疾病 控制程度的指标。
[0003]近年来，糖化血红蛋白（HbAlC)的检测日益受到临床的高度重视。HbAlC是指血 液中和葡萄糖结合了的那一部分血红蛋白。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的糖 化血红蛋白含量也会较高。人体内红细胞的寿命一般为120天，在红细胞死亡之前，血液中 HbAlC含量也保持相对不变。因此HbAlC水平反应了检测前120天内的平均血糖水平，而与 取血时间、病人是否空腹及是否使用胰岛素等因素无关，是判定糖尿病长期控制的良好指 标。
[0004]常用的糖化血红蛋白检测方法有微柱法离子交换层析、亲和层析、高压液相、免疫 凝集、离子捕获法、电泳法等。医院大型生化分析仪主要采用基于高效液相层析法原理的检 测方法，使用阳离子交换柱通过与不同带电离子作用来将血红蛋白组分分离。利用不同盐 浓度所形成的梯度洗脱液使得包括血红蛋白Alc在内的血红蛋白中的多种成分很快被分 离成多个部分，并用检测器对分离后的各种血红蛋白组分的吸光度进行检测。分析结束后， 以百分率表示的各种血红蛋白组分结果与层析图一起被传送到打印机，但是检测过程需要 专业操作人员；仪器比较大，不适合即时、就地监控糖化血红蛋白水平。
[0005]CN101622541A公开了一种糖化血红蛋白定量检测系统及使用该系统检测糖化血 红蛋白含量的方法，其中能同时检测血液中血红蛋白和糖化血红蛋白的系统装置包括侧流 分析检测试纸条、用于检测来自所述试纸条上固定捕捉物区域的荧光信号的激光诱导表面 荧光检测器、以及用于检测染料分析物的LED检测器，所述侧流分析检测试纸条是通过设 置糖化血红蛋白，通过竞争性免疫反应与样品中的分析物通过抗原-抗体反应结合。然而， 人糖化血红蛋白抗原纯制品非常昂贵，从而一定程度上限制了该检测技术的应用。
【发明内容】
[0006]本发明的主要目的在于提供一种新的糖化血红蛋白类似物的设计方案及制备方 法，并采用该糖化血红蛋白类似物制备快速检测糖化血红蛋白的层析试条，利用该层析试 条，可以快速、定量、简便的检测全血中的糖化血红蛋白含量。
[0007] 首先，本发明提供了一种新的糖化血红蛋白类似物，本发明设计的糖化血红蛋白 类似物可以代替昂贵的人糖化血红蛋白抗原纯制品用于制备检测糖化血红蛋白的层析试 条，与待检样本中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖化血红蛋白抗体。具体地，本发明 设计的一种糖化血红蛋白类似物是一种糖基化多肽，该糖基化多肽具有如下所示的序列结 构：
[0008] Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Cys。
[0009] 该糖基化多肽可以按照现有技术的方法首先合成糖基化的缬氨酸、然后再按照常 规多肽合成的方法逐次偶联上上述序列的氨基酸而制备获得。该糖基化多肽可在4°C保存 备用。
[0010] 另一方面，本发明还提供了一种糖基化多肽与载体蛋白的偶联物，该偶联物是本 发明所述的糖基化多肽的末端Cys偶联载体蛋白后的产物。本发明的糖基化多肽与载体蛋 白的偶联物也可作为一种糖化血红蛋白类似物代替昂贵的人糖化血红蛋白抗原纯制品用 于制备检测糖化血红蛋白的层析试条，与待检样本中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖 化血红蛋白抗体。
[0011] 根据本发明的具体实施方案，其中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA)、肌红蛋 白、或血蓝蛋白（KLH)，优选为牛血清白蛋白。
[0012] 另一方面，本发明还提供了所述糖基化多肽与载体蛋白的偶联物的制备方法，该 方法包括：
[0013] 将所述载体蛋白如牛血清白蛋白（BSA)经SMCC修饰，在水溶液中反应活化所述载 体蛋白，获得活化的载体蛋白（载体蛋白-SMCC)溶液；
[0014] 将所述糖基化多肽溶解于含0?IMEDTA的0?IMpH7. 2PBS溶液中；
[0015] 将上述糖基化多肽溶液加入到活化的载体蛋白溶液中，混合均匀得混合液，室温 放置1?3h;
[0016] 用0? 17%碳酸氢铵平衡S印hadexG25柱，将上述混合液上柱层析，淋洗液为0? 17% 碳酸氢铵；280nm波长下监控收集淋出液，有两个280nm峰形，其中第一个峰形的流出液是 糖基化多肽与载体蛋白的偶联物。
[0017] 另一方面，本发明还提供了所述的糖基化多肽、或所述的糖基化多肽与载体蛋白 的偶联物在制备检测糖化血红蛋的层析试条中的应用。
[0018] 根据本发明的具体实施方案，本发明所述的糖基化多肽、或所述的糖基化多肽与 载体蛋白的偶联物是代替人糖化血红蛋白抗原纯制品，与待检样品中的人糖化血红蛋白抗 原竞争结合人糖化血红蛋白抗体，从而进行检测。
[0019] 另一方面，本发明还提供了一种检测糖化血红蛋白的层析试条，该检测糖化血红 蛋白的层析试条上设有本发明所述的糖基化多肽、或所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联 物，以所述糖基化多肽或偶联物与待检样品中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖化血红 蛋白抗体，从而进行检测。
[0020] 根据本发明的具体实施方案，本发明的检测糖化血红蛋白的层析试条，可以按照 现有技术进行制备，本发明的关键在于以本发明所述的糖基化多肽、或所述的糖基化多肽 与载体蛋白的偶联物替代传统检测糖化血红蛋白的层析试条中的昂贵的人糖化血红蛋白 抗原纯制品。
[0021] 具体实施时，本发明所述的糖基化多肽、或所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联 物的用量可参照现有技术中人糖化血红蛋白抗原纯制品的用量。
[0022] 在本发明的一具体实施方案中，本发明的检测糖化血红蛋白的层析试条包括底板 以及在底板上依次顺序设置的样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸收垫；其中，按照待测样 品在试条上的层析流动的上下游方向：
[0023] 所述样品垫位于试条的起始端，其是用于接受待测样品，样品垫的末端与结合物 释放垫部分叠合；
[0024] 所述结合物释放垫的前端与样品垫部分叠合，末端与反应膜部分叠合；
[0025] 所述反应膜贴合在底板上，前端与结合物释放垫部分叠合，末端与吸收垫部分叠 合，且反应膜上未与结合物释放垫或吸收垫叠合的中间部分设置有检测区域，所述检测区 域设有权利要求1所述的糖基化多肽、或权利要求2或3所述的糖基化多肽与载体蛋白的 偶联物；
[0026] 所述吸收垫设置在试条距样品垫最远的位置，与反应膜的末端部分叠合。
[0027] 根据本发明的具体实施方案，本发明的检测糖化血红蛋白的层析试条中，所述 结合物释放垫上设有微球标记蛋白或胶体金标记蛋白，所述微球的直径范围为IOOnm? 300nm;优选地，所述标记蛋白为糖化血红蛋白单克隆抗体。
[0028] 根据本发明的具体实施方案，本发明的检测糖化血红蛋白的层析试条中，所述反 应膜上未与结合物释放垫或吸收垫叠合的中间部分还设置有对照区域，该对照区域设置在 检测区域的下游，对照区域内包被有糖化血红蛋白羊抗鼠二抗。
[0029] 根据本发明的具体实施方案，所述待测样品为全血。
[0030] 本发明的检测糖化血红蛋白的层析试条中，所述底板、样品垫、结合物释放垫、反 应膜和吸收垫的材质均可采用所属领域的常规材质。本发明对此不再赘述。
[0031] 优选地,本发明中的样品垫可以为pall公司的CytoSep膜，能过滤血样中的各类 血球细胞碎片。
[0032] 优选地，可以按照以下方法制备反应膜：在硝酸纤维素膜上，用点样仪以lul/cm 的量将2mg/ml的糖化血红蛋白类似物点成带状的检测区域；糖化血红蛋白类似物溶液事 先溶解于pH7. 0的IOmMPB中；以同样的办法再在试条的对照控制区包被羊抗鼠二抗，包被 好的膜均放于干燥、密闭的干燥箱中干燥并保存待用。
[0033] 优选地，可以按照以下方法制备彩色纳米微球-抗体结合物(微球标记蛋白）并进 一步制备结合物释放垫：
[0034] 先用MES缓冲液（pH6. 5)预处理彩色纳米微球；
[0035] 然后，将一定量的EDAC和NHS活化彩色纳米微球上的羧基官能团；
[0036] 加入抗体，使得抗体蛋白分子的氨基官能团与上述羧基共价结合，从而获得彩色 纳米微球-抗体结合物，用点样仪以IUVmm的量将彩色纳米微球-抗体结合物均匀得喷 涂于玻璃纤维素膜