一种人类8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶活性的比色分析方法
【专利摘要】本发明属于生物领域，涉及一种人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法。向0.1～5.0μM的S1中加入0.1～5.0μM的S2，85～100℃反应0.5～2min，10～30℃反应1～5min，交替反应8～15次，再加入hOGG1、BSA和NaBH3CN，35～40℃反应0.5～5h，80～100℃加热1～10min。加入ExoI和ExoIII，35～40℃静置10～60min，加入石墨烯/纳米金，混合均匀。依次加入显色剂和H2O2，进行吸光度测定。本发明的比色分析法比传统无机纳米材料分析方法成本低、操作简单、实用性强。
【专利说明】—种人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物领域，涉及一种人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法。
【背景技术】
[0002]在基因中，8-氧代鸟嘌呤是一种最常见的由于活性氧引起的DNA氧化损伤。在DNA复制过程中，这种损伤可以阻止DNA链伸长，导致由错配引起的基因突变，对基因稳定性产生了巨大威胁。由于其在机体内的含量高、诱变能力强，如今已被看作机体的DNA氧化损伤标志物。
[0003]在人体对损伤碱基的修复中，人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(human8-hydroxyguanine glycosylase,hOGGl)是一种重要的修复酶,它可以识别并切除8_氧代鸟嘌呤。此外,hOGGl还具有AP(apurinic/apyrimidinic)核酸内切酶的AP位点的水解功能，在该酶的作用下，可以将受损碱基的位点完全切除，形成一个空的位点，并在5’端位置形成磷酸末端。据此，hOGGl对机体DNA氧化损伤的修复有着重大的意义，故对其活性进行快速准确的定量分析是十分必要的。
[0004]传统的hOGGl活性分析方法有仪器法、生物法、生化法等，由于其固有的缺陷已难以应对目前的分析需求。例如，蛋白质印迹法操作复杂，对抗极端环境的适应性差、灵敏性差；流式细胞术、荧光测定实验耗时、费力、成本高；结合了天然酶的分子信标法虽然通过信号放大实现了高灵敏性，但实验的标记过程繁琐，且天然酶的稳定性差，阻碍了该法的推广应用。近年来，无机纳米材料由于其卓越的稳定性、反应活性和简单的制备过程，结合电化学、突光、比色技术，已被广泛运用于传感分析检测中(Nature nanotechnology, 2007，2(9)，577-583 !Environmental science and technology, 2012, 46(22),12567-12574 ;Journal of materials chemistry, 2012, 22(33), 17079-17085) ? 目前，人们也已利用无机纳米材料成功建立了一些针对hOGGl活性的传感分析平台(Analyticalchemistry, 2013，85(9)，4376-4383),但过程涉及繁琐的标记过程或复杂的操作步骤,影响了实验效率、分析结果和方法的实用性。
[0005]石墨烯/纳米金复合物，一种新型的无机过氧化酶催化材料，利用石墨烯与纳米金的接触界面的过氧化酶催化性质，可以快速催化氧化多种有机底物。此外，由于石墨烯片层与单链DNA之间的π-π共轭作用可使单链DNA自发的吸附到石墨烯表面，从而占据了石墨烯/纳米金复合物的界面活性位点，抑制了其过氧化酶催化性质。反应自发进行，无需标记过程。如今石墨烯/纳米金复合物材料由于其优异的性质，如制备过程简单、成本低、反应活性高等，已被用于传感分析中(ACS ΝΑΝ0，2012，6 (4) ,3142-3151)。本发明将石墨烯/纳米金复合物材料应用于样品中hOGGl的活性分析，建立一种hOGGl活性的比色分析方法，解决了传统方法繁琐耗时、成本高、实用性差等缺点，应用前景非常广泛。
【发明内容】
[0006]本发明解决了现有hOGGl活性分析方法繁琐耗时、标记过程复杂、成本高、实用性差等不足，提供了一种简便、快捷、经济、实用的hOGGl活性的定量分析方法。
[0007]石墨氧化物和氯金酸的混合液，在碱性条件下，经一步水热合成石墨烯/纳米金复合物，其界面的仿生过氧化酶催化性能可使底物中的显色剂在过氧化氢(H2O2)存在下，从常态氧化至氧化态，从而使体系吸光度值发生改变。含有8-氧代鸟嘌呤的DNA序列I与其互补DNA序列2杂交后，形成含有8-氧代鸟嘌呤的双链DNA。当目标物hOGGl存在于体系中时，其作用的DNA底物会形成shifT碱，在还原剂氰基硼氢化钠的作用下与DNA双链共价结合，阻碍了随后加入的核酸外切酶对序列I的降解作用，而不含有8-氧代鸟嘌呤的序列2则被核酸外切酶降解。捕获目标物hOGGl的序列I由于其与石墨烯之间的π-Ji共轭作用而吸附到石墨烯/纳米金复合物表面，阻碍了复合物的界面过氧化酶催化性能，在显色剂与H2O2存在条件下，不能使反应体系吸光度产生变化。反之，当体系中不存在目标物hOGGl时，序列I与序列2形成的双链DNA则会被核酸外切酶降解，由于所加入的石墨烯/纳米金复合物的界面过氧化酶催化性能，在H2O2存在条件下氧化显色剂，使反应体系吸光度产生变化。据此，体系的吸光度值在一定范围内与目标物hOGGl的活性呈线性反相关，从而为hOGGl的定量分析提供依据。
[0008]本发明提供了一种人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法，具体步骤如下:
[0009](I)向0.1?5.0 μ M的DNA序列SI溶液中加入浓度为0.1?5.0 μ M的DNA序列S2溶液，在85?100°C温度下反应0.5?2min，继续在10?30°C温度下反应I?5min，如此温度交替反应8?15次，使DNA序列SI与DNA序列S2杂交反应成双链DNA。其中，所述的DNA序列SI为含有8-氧代鸟嘌呤的DNA序列，DNA序列S2为DNA序列SI的互补DNA序列。
[0010](2)依次向步骤⑴获得的双链DNA溶液中加入活性值不大于0.5U/μ L的hOGGl、0.01?1.0mg/mL牛血清蛋白和0.01?1.0M氰基硼氢化钠，在35?40°C温度下反应0.5?5h，使hOGGl捕获到DNA序列SI上。然后在80?100°C温度下反应I?lOmin，终止反应。
[0011](3)向步骤⑵获得的混合液中加入0.05?1.5υ/μ L核酸外切酶I (Exo I)和0.2?8.0U/μ L核酸外切酶III (Εχο III)，35?40°C温度下静置10?60min。再加入
0.5?40.0 μ g/mL石墨烯/纳米金,混合均勻。
[0012](4)向步骤⑶得到的产物中依次加入0.05?10.0mM显色剂与L O?100.0mM过氧化氢(H2O2)，将得到的混合液立即进行吸光度测定。
[0013]所述的显色剂包括四甲基联苯胺(TMB)或2，2_联氮-二(3_乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)。
[0014]本发明的有益效果:
[0015](I)灵敏度高，检测下限可达0.0016U/yL。
[0016](2)石墨烯/纳米金复合物采用水热反应一步合成，过程简单、快捷。
[0017](3)相较于传统无机纳米材料分析方法，无标记过程，操作简单、实用性强。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本发明所述的hOGGl的活性分析方法示意图。
[0019]图2是本发明的方法获得的hOGGl活性分析的标准工作曲线。
[0020]图中:DNA序列 SI ；DNA 序列 S2 ；】hOGGl ；石墨稀 / 纳米金。
【具体实施方式】
[0021]以下结合技术方案和附图具体说明本发明的【具体实施方式】。
[0022]实施例1
[0023]石墨烯/纳米金的制备
[0024]石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将0.01?lg/L石墨氧化物(GO)溶液，0.2?20.0mM氯金酸(HAuCl4)溶液，0.002?0.2M氢氧化钠(NaOH)溶液混合均匀。超声2?12h后，转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中，175?185°C反应8?12h，自然冷却至室温后备用。
[0025]实施例2
[0026]配置样品中hOGGl含量的测定:
[0027](I)石墨烯/纳米金的制备
[0028]石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将0.01g/LG0溶液，0.2mMHAuCl4溶液，
0.004MNa0H溶液混合均匀。超声2h后，转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中，175°C反应12h，自然冷却至室温后备用。
[0029](2) SI 与 S2 杂交
[0030]向0.中加入浓度为0.ΙμΜ的S2，在85°C温度下反应2min，10°C温度下反应Imin,如此温度交替循环反应8次。
[0031](3)分析方法
[0032]依次向步骤⑵获得的双链DNA溶液中加入O?0.2U/μ L hOGGl，0.01mg/mL BSA与0.0lM NaBH3CN,在35°C温度下反应5h，80°C温度下加热1min终止反应。然后向混合液中加入 0.05U/y LExo I 与 0.2U/yLExo III，在 35°C温度下静置 60min 后，加入 0.8 μ g/mL石墨烯/纳米金，混合均匀。最后加入0.1mMTMB与1.0mM H2O2,并立即将得到的混合液转入比色皿中。室温条件下，于波长为652nm处测定反应体系吸光度值随时间变化情况。
[0033](4)标准工作曲线的绘制
[0034]步骤(3)中随着样品中hOGGl活性值的增加，体系的吸光度变化值不断增加，在O?0.1U/ μ L范围内，600s时反应体系吸光度值与hOGGl活性有良好的线性关系，线性相关系数R = 0.997。
[0035](5)配置样品中hOGGl活性的测定:
[0036]用工作缓冲液(50.0mM NaCl, 10.0mM Tris-HCl, 10.0mMMgCl, 1.0mM DTT，ρΗ7.9)配置活性为0.07U/yL的hOGGl待测样品，用步骤(3)的方法进行检测，检测结果与步骤(4)得到的标准工作曲线对比，计算出hOGGl的活性值。实验结果测出hOGGl活性为
0.072U/yL，回收率为102.9%，相对标准偏差RSD为2.71 % (η = 4)。
[0037]实施例2的DNA序列如表I所示，oxoG为8_氧代鸟嘌呤。
[0038]表IDNA 序列
[0039]
名称序列
515’ -AATGGAGCACATCAGTT—GAGCTCCATT-3’
525 ’ -AATGGAGCTCAACTGATGTGCTCCATT-3?
[0040]实施例3
[0041]配置样品中hOGGl含量的测定:
[0042](I)石墨烯/纳米金的制备
[0043]石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将0.lg/LGO溶液，2.0mMHAuCl4溶液，
0.02MNa0H溶液混合均匀。超声6h后，转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中，180°C反应1h,自然冷却至室温后备用。
[0044](2) SI 与 S2 杂交
[0045]向0.9μ M的SI中加入浓度为1.(^11的52，在951:温度下反应11^11，251:温度下反应2min,如此温度交替循环反应10次。
[0046](3)依次向步骤⑵获得的双链DNA溶液中加入O?0.23U/ μ L hOGGl，0.lmg/mLBSA与0.1MNaBH3CN,在37°C温度下反应2h，90°C温度下加热5min终止反应。然后向混合液中加入 0.3U/μ LExo I 与 1.5U/μ LExo III，在 37°C温度下静置 20min 后，加入 7.9 μ g/mL石墨烯/纳米金，混合均匀。最后加入1.0mM TMB与30.0mMH2O2,并立即将得到的混合液转入比色皿中。室温条件下，于波长为652nm处测定反应体系吸光度值随时间变化情况。
[0047](4)标准工作曲线的绘制
[0048]步骤(3)中随着样品中hOGGl活性值的增加，体系的吸光度变化值不断增加，在O?0.1lU/ μ L范围内，600s时反应体系吸光度值与hOGGl活性有良好的线性关系，线性相关系数R = 0.998。
[0049](5)配置样品中hOGGl活性的测定:
[0050]用工作缓冲液(50.0mM NaCl, 10.0mM Tris-HCl, 10.0mMMgCl, 1.0mMDTT,pH7.9)配置活性为0.09υ/μ L的hOGGl待测样品，用步骤(3)的方法进行检测，检测结果与步骤(4)得到的标准工作曲线对比，计算出hOGGl的活性值。实验结果测出hOGGl活性为0.086U/μ L，回收率为95.6%，相对标准偏差RSD为2.66% (η = 4)。
[0051]实施例3的DNA序列如表2所示，oxoG为8_氧代鸟嘌呤。
[0052]表2DNA 序列
[0053]
名称序列
515’ -GAGAATGGAGCACATCAGTT°X°GAGCTCCATTCTC-3’
525’ -GAGAATGGAGCTCAACTGATGTGCTCCATTCTC-3’
[0054]实施例4
[0055]配置样品中hOGGl含量的测定:
[0056](I)石墨烯/纳米金的制备
[0057]石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将lg/LGO溶液，20.0mMHAuCl4溶液，0.18MNa0H溶液混合均匀。超声12h后，转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中，185°C反应8h，自然冷却至室温后备用。
[0058](2) SI 与 S2 杂交
[0059]向5.0 μ M的SI中加入浓度为5.0 μ M的S2，在100°C温度下反应0.5min，30°C温度下反应5min,如此温度交替循环反应15次。
[0060](3)依次向步骤⑵获得的双链DNA溶液中加入O~0.5U/yL hOGGLl.0mg/mL BSA与1.0M NaBH3CN,在40°C温度下反应0.5h，100°C温度下加热2min终止反应。然后向混合液中加入L 5U/μ LExo I与8.0U/μ LExo III，在40°C温度下静置1min后，加入40.0 μ g/mL石墨烯/纳米金，混合均匀。最后加入10.0mMABTS与100.0mM H2O2,并立即将得到的混合液转入比色皿中。室温条件下，于波长为405nm处测定反应体系吸光度值随时间变化情况。
[0061](4)标准工作曲线的绘制
[0062]步骤(3)中随着样品中hOGGl活性值的增加，体系的吸光度变化值不断增加，在O~0.3U/y L范围内，600s时反应体系吸光度值与hOGGl活性有良好的线性关系，线性相关系数R = 0.991。
[0063](5)配置样品中hOGGl活性的测定:
[0064]用工作缓冲液(50.0mM NaCl, 10.0mM Tris-HCl, 10.0mMMgCl, 1.0mM DTT，ρΗ7.9)配置活性为0.23U/y L的hOGGl待测样品，用步骤(3)的方法进行检测，检测结果与步骤
(4)得到的标准工作曲线对比，计算出hOGGl的活性值。实验结果测出hOGGl活性为0.2IU/μ L，回收率为91.3%，相对标准偏差RSD为3.19% (η = 4)。
[0065]实施例4的DNA序列如表3所示，oxoG为8_氧代鸟嘌呤。
[0066]表3DNA 序列
[0067]
【权利要求】
1.一种人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法，其特征在于，步骤如下: (1)向0.1?5.0 μ M的DNA序列SI溶液中加入浓度为0.1?5.0 μ M的DNA序列S2溶液，在85?100°C温度下反应0.5?2min，继续在10?30°C温度下反应I?5min，如此温度交替反应8?15次，使DNA序列SI与DNA序列S2杂交反应成双链DNA ;其中，所述的DNA序列SI为含有8-氧代鸟嘌呤的DNA序列，DNA序列S2为DNA序列SI的互补DNA序列； (2)依次向步骤⑴获得的双链DNA溶液中加入活性值不大于0.5U/yL的hOGGl、0.01?1.0mg/mL牛血清蛋白和0.01?1.0M氰基硼氢化钠，在35?40°C温度下反应0.5?5h，使hOGGl捕获到DNA序列SI上；然后在80?100°C温度下反应I?lOmin，终止反应； (3)向步骤(2)获得的混合液中加入0.05?1.5U/ μ L核酸外切酶I和0.2?8.0U/μ L核酸外切酶III，35?40°C温度下静置10?60min ;再加入0.5?40.0 μ g/mL石墨烯/纳米金，混合均勻； (4)向步骤(3)得到的产物中依次加入0.05?10.0mM显色剂和1.0?100.0mM过氧化氢，将得到的混合液立即进行吸光度测定。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的显色剂为四甲基联苯胺或2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐。
【文档编号】G01N21/78GK104165884SQ201410203778
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年5月15日 优先权日:2014年5月15日
【发明者】赵慧敏, 袁芳, 刘猛, 全燮, 张耀斌 申请人:大连理工大学