由于脯氨酸残基突变而具有降低的致敏性的禾本科的第6组过敏原的变异体的制作方法

专利名称：由于脯氨酸残基突变而具有降低的致敏性的禾本科的第6组过敏原的变异体的制作方法
技术领域：
本发明涉及天本疼第6组过敏原的重组变体的制备和用途，其特征在于相对于已知野生型过敏原的降低的IgE反应性以及同时很大程度地保持与T淋巴细胞的反应性。可以采用这些低过敏性过敏原变体用于患有草花粉过敏的患者的特异性免疫治疗(脱敏)或者用于防止形成草花粉过敏的预防性治疗。本发明一个优选的实施方式涉及梯牧草/Traiefl1Si )的过敏原Phl ρ 6的变体，其中29、30、57、79位的脯氨酸被单独或组合突变。发明背景 I型过敏具有全球重要性。在工业化国家最高至20%的人口受疾病如过敏性的鼻炎、结膜炎或支气管哮喘之苦。这些过敏由各种源头如树和草(花粉)、真菌(孢子)、螨虫(排泄物)、猫或狗的来源引起。这些过敏源被直接释放进入空气(花粉、孢子)或可以与柴油炭黑颗粒(草花粉)或室内灰尘(螨排泄物、皮肤颗粒、毛发)相结合进入空气。由于引发过敏的物质位于空气中，所以也被称作气源性过敏原。I型引发过敏物质是蛋白质、糖蛋白或多肽。在经由粘膜摄取后，这些过敏原与结合在敏感人的肥大细胞表面的IgE分子反应。如果这些IgE分子通过过敏原彼此交联，这导致通过效应细胞分泌介质(例如组胺、前列腺素类)和细胞因子，并因此导致相应的过敏症状。最高40%的I型过敏患者表现出与禾本科的花粉提取物的特异性IgE反应性(Burney 等，1997, J. Allergy Clin. Tmmunol. 99:314-322; D，Amato 等，1998, Allergy53: 567-578; Freidhoff 等，1986, J. Allergy Clin Immunology,78,1190-2002)。禾本科(Poaceae)科包括超过10000种，其中迄今已知远超过20种为过敏症状的触发物(Andersson & Lidholm,2003, Int. Arch. Allergy Tmmunol. 130:87-107; Esch,2008,Allergens and Allergen Immunotherapy, Clinical Allergy and Immunology Series,107-126)。大部分的引发过敏的禾本科属于早熟禾亚科亚科。除了以野生形式存在的草种，例如，绒毛草(Ho I CU s水薦草 iPhalaris黄花茅(Anthoxanthumodoratum)> {Dactylis glomerataX 草甸羊芽(Festuca pratensis )> Jftiiil
{Poa pratensis )或黑麦草pere/we),种植谷物,如</、麦aestivum)^黑麦iSecale cereale、取大麦iHordeum raJgare),也是该亚科的已知成员。关于其过敏原已经被研究得最透彻的早熟禾亚科(Pooideae)种之一是梯牧草(.Phleum pratense),它作为野生植物在世界范围广泛分布,并且作为牧草植物和耐寒的饲料草发挥了商业作用。取决于各过敏原分子与过敏症患者的IgE抗体反应在人群中的相对频率，区分为主要-和次要过敏原。六种梯牧草的过敏原可以被视为主要的过敏原Phl P I (Petersen等，1993，J. Allergy Clin. Tmmunol. 92: 789-796)、Phl ρ 5 (Matthiesen 和 L5wenstein, 1991，Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen 等，1992, Int. Arch. Allergy Tmmunol ·98: 105-109)、Phl p 6 (Petersen 等，1995，Int. Arch. Allergy Tmmunol. 108,49-54)、Phl p 2/3 (Dolecek 等，1993，FEBS 335 (3): 299-304)、Phl p 4 (Haavik 等，1985，Int.Arch. Allergy AppI. Tmmunol. 78: 260-268; Valenta 等，1992, Int. Arch. AllergyImmunol. 97: 287-294; Nandy 等，Biochem. Biophys. Res. Commun.,2005,337(2):563-70)和 Phl p 13 (Suck 等，2000，Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402)。Phl p 6的第一次描述早在1978年已进行。从梯牧草花粉纯化的一个蛋白质组分被称为“Agl9”，包含约15 kDa大小的过敏原，其后来在正式的过敏原命名 分类中被分类，并作为 Phl ρ 6 继续使用(L0wenstein, 1978, Allergy 33: 30-41; WH0/IUIS 过敏原分类命名委员会，www. allergen, org)。Phl ρ 6被归类为主要过敏原，因为Phl ρ 6反应性IgE抗体可以在约70%的草花粉过敏患者中检测到(Rossi等，2001，Allergy, 56: 1180-85;Vrtala 等，1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9)。通过对来自草花粉提取物的过敏原的物理化学研究可证实一级序列不同的两种蛋白变体(Blume等,2004, Proteomics 4: 1366-71).这些异构体是归因于在梯牧草花粉表达文库中经鉴别的两个cDNA序列，并且具有WHO/ IUIS命名为Phl p 6.0101 (GenBank:Ζ27082. I; UniProt: Ρ43215;见图 15 和 16 或 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO: 4，带前肽的见图 19 或 SEQ ID NO:9; Petersen 等，1995, Int. Arch. Allergy Tmmunol. 108: 55-59)和 Phl ρ 6. 0102 (GenBank: Y16955; UniProt: 065868;见图 3 和 4 或 SEQ ID N0:1 和SEQ ID NO: 2，带前肽的见图 20 或 SEQ ID NO: 10; Vrtala 等，1999，J. Immunol. 15;163:5489-9)。除了信号肽，所述蛋白质各由110个氨基酸组成，且仅在两个位置不同(Val14 —Ile和Arg 95 — His，由成熟的Phl ρ 6. 0101开始)，这导致了 5 Da的分子量的差异(Phl ρ 6. 0101 的 11790 Da 相对于 Phl ρ 6. 0102 的 11785 Da，图 I)。禾本科、尤其是早熟禾亚科的其它禾本科种的花粉可包含与梯牧草的过敏原同源的主要过敏原。在种间存在的这种过敏原被概括为过敏原组。最终基于相似的氨基酸序列的这种近缘的过敏原的高结构同源性相应地造成分子与IgE抗体的高交叉反应性(Lorenz等,2009, Int. Arch. Immunol. 148:1_17)。还已知,对梯牧草的主要过敏原过敏性反应的遗传性过敏症患者会主要由梯牧草的其他近缘物种之一致敏。最后，由于这种交叉反应,能够通过一种草种的致敏足以弓I发对其他近缘草的过敏反应。在草地早熟禾(/^oa /Traiefl1Si1S)的花粉中已在蛋白质水平证明了与Phl ρ 6交叉反应的第 6 组过敏原(Vrtala 等，1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9; Niederberger 等，1998，J. Allergy Clin. Immunol. 101 (2): 258-264)。除了第6组过敏原相互间的交叉反应性，还已知与第5组的主要过敏原的交叉反应性。Phl P 6的多肽链表现出与Phl P 5的N-末端约26-28 kDa大小的区域大的相似性(图I、图2)。据估计，过敏原可以归因为共同的初始基因(Petersen等，1995，Int.Arch. Allergy Immunol. 108:55-59)。这两种蛋白质均形成α -螺旋的二级结构，但没有形成β_折叠结构。X-射线结构分析表明，Phl ρ 6的四个α-螺旋折叠成了独特的螺旋束(RCSB蛋白质数据库条目1NLX; Fedorov等，2003 ;2003 ;

图1)，一种在Phl ρ 5的片段中也能被证明的结构(Rajashankar 等，2002, Acta Cryst. D58:1175-1181; Maglio等,2002,Protein Engineering 15: 635-642; Wald 等，2007, Clin. Exp. Allergy 37:441-450).过敏原间的相似性导致Phl ρ 5-反应性IgE抗体也结合在Phl ρ 6上(Petersen等，1995,Int. Arch. Allergy Tmmunol · 108: 49-54; Andersson & Lidholm,2003, Int. Arch.Allergy Tmmunol. 130:87-107)。特异性免疫治疗(SIT)或脱敏被视为过敏的治疗处理的有效方法(Fiebig 1995Allergo J. 4 (6) : 336-339, Bousquet 等，1998, J. Allergy Clin. Tmmunol. 102 (4):558-562; Cox等，2007,J. Allergy Clin. Tmmunol· 120:S25-85; James & Durham,2008,Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088)。近百年来，注射疗法的传统治疗形式(SCIT)(其中将天然的过敏原提取物以逐渐增加的剂量皮下注入患者)已成功使用。在该疗法中，过敏症患者的免疫系统一再被迫面 对过敏原，由此获得了与对过敏原的耐受性相联系的免疫系统的重新编程。在通过抗原递 呈细胞摄取得自过敏原制备物的抗原后，抗原的多肽被递呈至细胞表面上。一些包含所谓的T细胞表位的特定肽被抗原特异性T细胞识别。这种结合尤其导致各种类型的具有调节功能的T细胞的形成。在SIT期间，调节性T细胞应答导致对过敏原的耐受、Th2细胞因子的下调、Th1/Th2平衡的恢复、过敏原特异性IgE的抑制，IgG4、IgGl和IgA抗体的诱导、效应细胞(肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)的抑制以及炎症组织的更新(Akdis等，2007, J. Allergy Clin. Tmmunol. 119 (4):780-789; LarchS 等，2008, Nature Reviews6:761-771)。因此T细胞表位对于过敏原制备物在脱敏时的治疗作用至关重要。由于存在于IgE和也存在于T细胞水平的梯牧草的主要过敏原的交叉反应性，用单一代表性的草种的过敏原提取物的成功治疗通常是足够的(Mailing等，1993，EAACIPosition Paper: Immunotherapy, Allergy 48: 9-35; Cox 等，2007, J Allergy ClinTmmunol 120: 25-85)。除了皮下免疫治疗，舌下治疗形式(其中过敏原或过敏原衍生物通过口腔黏膜摄取，作为注射疗法的替代用于临床试验和应用(James & Durham，2008，Clin. Exp.Allergy 38: 1074-1088)。另一种可能性是用编码相关过敏原的可表达的DNA治疗(免疫治疗性接种)。在啮齿类动物上通过注射编码过敏原的DNA提供了对免疫应答的过敏原特异性影响的实验证据(Hsu 等· 1996, Nature Medicine 2 (5) : 540-544, Weiss 等，2006, Int. Arch. AllergyTmmunol. 139: 332-345)。在所有这些治疗形式中，存在着过敏反应或者甚至过敏性休克的根本性风险(Kleine-Tebbe, 2006, Allergologie, 4:135-156)。为了使这些风险最小化，米用了类过敏原(Allergoid)形式的新颖的制备物。这些是化学修饰的过敏原提取物，其具有明显降低IgE反应性，但与未处理的提取物相比，具有相同的T细胞反应性(Fiebig 1995 AllergoJ. 4 (6) :336-339, Kahlert 等，1999, Int. Arch. Allergy Tmmunol , 120: 146-157)。治疗优化用重组制备的过敏原是可行的。给定的，任选与患者的个体致敏模式相一致的重组方法制备的高纯度过敏原的鸡尾酒可以替代来自天然过敏源的提取物，因为，除了各种过敏原，后者包含相对大量的免疫原性的、但非过敏性伴随蛋白质。重组过敏原的初步临床研究已经成功实施(Jutel等,2005,J. Allergy Clin. Immunol. , 116: 608-613;Valenta & Niederberger,2007, J. Allergy Clin. Tmmunol. 119: 826-830)。突变的重组过敏原(其中IgE表位被改变，在不损害对治疗必需的T细胞表位)有针对性地提供了能够用重组表达产物导致安全脱敏的现实前景(Schramm等.1999，J.Immunol. 162:2406-2414)。所述低过敏性的蛋白质可以以较高的计量在SIT期间使用，而在此不增加不期望的IgE促进的副作用的概率。在过去，对于许多气源性过敏原(尤其花粉-和室内灰尘螨虫过敏原)和食物过敏原而言，已经公开了这种具有降低的IgE结合性的“低过敏性”变体。从未改变DNA的过敏原开始，尤其可以通过过敏原个别区段的片段化、寡聚化、缺失、点突变或重组(DNA重排)制备并表达重组 DNA (Ferreira 等，2006, Inflamm. & Allergy - Drug Targets 5: 5-14;Bhalla & Singh,2008,Trends in Biotechnology 26:153-161; Westritschnig 等，2007，J. Immunol. 179: 7624-7634)。
关于草的第6组过敏原，至今仅发表了单一突变策略，其中缺失了用于编码成熟Phl ρ 6的氨基酸1-30的前90个核苷酸。将该分子表达为组氨酸融合分子，净化并研究其免疫学特性。N-末端缺失导致减弱的IgE结合力以及减小的嗜碱性粒细胞可刺激性(Vrtala 等，2007，J. Immunol. 179: 1730-1739)。在以后的论文中，同样的分子与 Phl ρ2的重组变体相连成为杂交分子(Linhart等，2008，Biol. Chem. 389: 925-933)。对于第6组的草花粉过敏原而言，迄今仍没有公开如用于其它过敏原所述的基于点突变的突变策略。本发明基于的目标在于在蛋白质-和DNA水平上提供彦本科的第6组的新型变体，其特点为降低IgE反应性同时很大程度地保留T细胞反应性，并因此适合用于治疗和预防特异性免疫治疗和免疫治疗性DNA接种。

发明内容
令人惊讶地已经发现，这样的天本科{Poaceae)的第6组过敏原的变体与野生型的过敏原相比具有降低的IgE的反应性，同时很大程度地保留的与T淋巴细胞的反应性，并因此是低过敏性的，在所述禾本科iPcmC(me)中脯氨酸单独或组合突变，所述脯氨酸对应于比对中野生型Phl ρ 6的氨基酸序列中位置29、30、57、79的脯氨酸。因此本发明提供禾本科iPcmcGae)的第6组过敏原的低过敏性变体，在所述禾本科中脯氨酸单独或组合突变，所述脯氨酸对应于比对中野生型Phl P 6的氨基酸序列中位置29、30、57、79的脯氨酸。尤其优选的是根据本发明的过敏原变体，其特征在于，脯氨酸缺失或被取代。优选根据本发明的低过敏性的第6组过敏原的变体，所述过敏原来自早熟禾亚科)亚科，优选来自早熟禾超族)和Triticodae,优选代表为猫尾草iPhleum pratense)、绒毛草{HoIcus Ianatus)、水生薦iPhalaris aquatica)、黄花茅(Anthoxanthum odoraturn)、甲鸟茅iDactylis glomerata、、黑麦草perenne)、草iiil -￥· iPoa pra ten si 5 ) > ^ ^ ^ {Fes tuca pratensis、、欠轰 iHordeum vu lgare ) >黑麦cereale)热轰(Jriticum aestivum、。优选的是根据本发明的来自小麦(.Tri ticum aes ti vum ) > H ^ (Secale cereale.)取大轰(Mordeum vu lgare) StJ Tri a 6、Sec c 6和Hor v 6的低过敏性变体。尤其优选根据本发明的早熟禾超族(/^oot/ae)的第6组过敏原的低过敏原变体。这些第5组过敏原优选来自猫尾草/Traiefl1Si )、黑麦^iLolium fere/we)、草地早熟禾(/ba pratensism毛MXHolcus 7a/ aiw5·)和水生薦(.Phalari s aqua ti ca)的 Phl ρ 6、Poa ρ 6、Hol ρ 6、Lol ρ 6 和 Pha a 6,并且最特别优选的是Poa ρ 6和Phl ρ 6，尤其为Phl ρ 6。上面提到的过敏原及其前体蛋白的所有自然存在的同分异构体、同质多形体和变体也是根据本发明的。在根据本发明的低过敏性变体中，优选的是突变的脯氨酸，其在比对中对应于成熟Phl ρ 6. 0101 或其变体(SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8)或成熟Phl ρ 6.0102(SEQ ID NO:2)、尤其优选成熟Phl ρ 6. 0102的氨基酸序列中的位置29、30、57、79的脯氨酸。尽管已知脯氨酸会对蛋白质结构产生影响，但将有针对性的脯氨酸残基的点突变作为形成过敏原的低过敏性突变体的起始点仅对尘螨farinae的第2组主要过敏原的(Der f 2，脯氨酸残基残基被丙氨酸替代)进行了研究(Takai等，2000， Eur. J. Biochem. 267:6650-6656)。然而，在3个点突变的情况下，IgE结合能力和刺激嗜碱性细胞的能力只是略有下降，而其他三个的情况如同未修饰的过敏原。在Der f 2情况下，脯氨酸突变因此表现出过敏性的仅仅非常微弱的降低或者没有降低。没有公开通过脯氨酸交换突变制备低过敏性突变体的进一步策略。因此，本领域技术人员不能预期脯氨酸突变将成功地作为产生过敏原的低过敏性突变体的起点。此外，迄今没有对任何过敏原进行研究，脯氨酸残基的特异性缺失如何对表达产物的整个IgE的结合能力产生影响以及对过敏相关的效应细胞的活化发生何种影响。成熟的Phl ρ 6 或两种异构体(Phi ρ 6. 0101, GenBank:Ζ27082. I,UniProt:P43215; Phl ρ 6. 0102, GenBank:Υ16955, UniProt:065868)的氨基酸序列具有 7个脯氨酸残基(图I)。氨基酸位置29、30、57、79和101的的脯氨酸直接位于α-螺旋的开头或末端，并且参与蛋白质表面的形成(图2)。61位的脯氨酸残基是第三个螺旋的组成部分，而脯氨酸108位于C末端附近。从Phl ρ 6 异构体 Phl ρ 6.0101 (SEQ ID NO:4)和 Phl p 6.0102 (SEQ ID NO2)的氨基酸序列出发制备重组的未修饰的野生型过敏原(rPhl ρ 6 wt;图4)和基因改变的根据本发明的变体。与以下描述的制备方法相类似，也可以制备其它根据本发明的禾本科的第6组过敏原(例如Poa ρ 6)的野生型蛋白和根据本发明的低过敏性变体。为此，优选通过替代或缺失使脯氨酸单独或组合突变，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phl ρ 6的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。根据本发明的过敏原变体适合于借助基因工程方法从克隆的DNA序列开始制备。根据本发明的制备方法是本领域技术人员从相关的实验室操作规程和出版物已知的，例如 E. F. Fritsch, J. Sambrook, T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring HarborLaboratory Press，1989。对于所述的第6组过敏原的变异，在其它位置的进一步改变-例如为了增加低过敏性-自然也是可能的。这些修饰可以是，例如，氨基酸插入、氨基酸缺失、氨基酸替换和蛋白质裂解成片段和蛋白质或其与其它蛋白质或多肽的片段的融合以及通过相同的蛋白质或片段融合的多聚体。
根据本发明的片段优选包含20-109个氨基酸，优选30-100个氨基酸，尤其优选40-90个氨基酸。此外，本发明的变体包括例如在图18、19和20(SEQ ID N0:8,SEQ ID N0:9,SEQ ID NO: 10)中所述的具有前导的天然或人工的信号序列的前体蛋白，例如，ProPhl ρ
6。此外，根据本发明的是具有N-或C-末端融合标签(例如如图5和6中的His标签、MBP标签、表达调控序列等)的融合蛋白质、杂合分子，如，例如，具有其它过敏原或其低过敏性变体的融合物或以任何期望序列的片段的融合物。此外，本发明的变体还包括具有至少80%的氨基酸序列与相关的第6组野生型过敏原具有同一性、优选至少90%的氨基酸序列与相关的第6组野生型过敏原具有同一性、尤其优选至少95%的氨基酸序列与相关的第6组野生型过敏原具有同一性的同源序列(同质多形体(SNPs)，异构体)。在这些变体中，一个或几个氨基酸优选被保守替换，例如极性氨基酸被另一个极性氨基酸取代或中性氨基酸被另一个中性氨基酸取代，但是被非保守取代的变体也是根据本发明的。多聚体优选包括通过连接序列连接的或直接融合的根据本发明的低过敏性变体的二聚体或三聚体。这种变体的例子是按照图17和18的Phl ρ 6. 0101的变体(SEQ ID NO: 7,SEQ IDΝ0:8)，其中与本发明的作用无关的单个氨基酸已经被取代，或在N末端缺失三个氨基酸， 或其在N末端具有信号肽的前体序列以及类似物。本发明的变体的另外的例子是同质多形的变体，例如，两种异构体Phl ρ 6. 0101和Phl ρ 6. 0102本身，和具有一个或多个氨基酸替换、在N-和/或C-末端具有一个或多个氨基酸缺失或在氨基酸序列内具有相应的缺失缺口的另外的变体。在氨基酸序列内或在N-和/或C末端在不同位置中具有单个或多个氨基酸个别插入的或作为一个组插入的变体同样是根据本发明的。因此本发明还提供禾本科(Poaceae)的第6组过敏原的低过敏性变体，其特征在于，它是根据本发明的低过敏性变体的片段或变体，或是根据一种或多种根据本发明的低过敏性变体的多聚体，或者其特征在于，一种或多种根据本发明的低过敏性变体或其片段、变体或多聚体是重组融合蛋白的组成部分。此外，本发明提供编码根据本发明的低过敏性变体的DNA分子。本发明进一步提供包含与表达控制序列功能性连接的这种根据本发明的DNA分子的重组表达载体。表达控制序列是指，启动子或借助于其影响目标蛋白表达和功能性连接于目标基因但不必必须位于目标基因的直接邻近处的序列区段。根据本发明还提供用根据本发明的DNA分子或根据本发明的表达载体转化的非人宿主生物。根据本发明还提供通过培养根据本发明的非人宿主生物和获得得自配养物的相应的过敏原变体的制备根据本发明的低过敏性变体的方法。适合的非人类宿主生物可以是原核或真核的、单细胞或多细胞生物，如细菌或酵母菌。根据本发明优选的宿主生物是大肠杆菌(疋coli\可以通过脯氨酸57的、脯氨酸79和脯氨酸101的脯氨酸29 + 30的缺失来研究单个或两个紧紧相邻的脯氨酸的缺失对Phl ρ 6的IgE结合能力的影响。在Phl ρ 6野生型蛋白中，这些脯氨酸位于α-螺旋的开头或末端的环区域内(图I ;图2)。脯氨酸61和脯氨酸108优选不改变，因为相应的变体未表现显著的效果。可以类似地研究根据本发明的禾本科的其它第6组过敏原例如Poa ρ 6的对应的同源位置中的脯氨酸突变对IgE结合能力的影响。
为更快地高产量纯化，为这些研究提供了具有编码N-末端六-组氨酸-融合部分(+6His)的序列的编码DNA(图5，SEQ ID NO:5;图6，SEQ ID NO:6) 可以同样按照标准方法纯化药用目的可使用的根据本发明的无标签的变体和野生型的蛋白质并确认His标签蛋白的结果。相应地制备例如编码蛋白质rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl ρ 6 d[P57] +6His、rPhl p 6 d[P79] + 6His 和 rPhl p 6 d[P101] + 6His 的序列。可以在所有已知的真核和原核表达系统、优选在大肠杆菌中表达所述序列。随后用标准方法纯化作为可溶性单体的蛋白。最后，可以通过在变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS - PAGE)中分析而检查纯度(图7)。与折射仪(RI检测器)和多角度光散射检测器(MALS探测器)偶联的分析凝胶过滤(SEC)允许在线测定洗脱蛋白质的分子量(SEC/MALS/RI方法)。因此，通过SEC/MALS/RI 的 rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl ρ 6 d[P57] + 6His、rPhl ρ 6 d[P79] + 6His 和 rPhl ρ 6 d[P101] + 6His 分析显示根据本发明的变体
在溶液中作为纯单体存在(图8，表I)。可以通过其中蛋白质被固定在硝酸纤维素膜上并与临床确定的草花粉过敏症患者的个体血清的IgE抗体相接触的方法确定根据本发明的重组变体的IgE结合能力(带测试)。随后通过酶反应使过敏原变体/抗体复合物显色(图9)。在该方法中，突变体rPhl ρ 6 d[P101] + 6His表现出与未修饰的过敏原相同的良好的与所有测试血清的IgE结合力(图9)。因此，脯氨酸101的缺失对Phl ρ 6的IgE结合能力没有显著影响。突变体rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl ρ 6 d[P57] + 6His和rPhl ρ 6 d[P79] + 6His的IgE结合力在不同的草花粉过敏症患者的血清中差别尤其显著。这是由各过敏症患者的IgE群体的组成中的IgE抗体的亲和力和表位特异性的变化而产生。相比于未修饰的rPhl ρ 6 wt + 6His,突变体rPhl p 6 d[P57] + 6His和rPhl ρ6 d[P79] + 6His显示出与大部分血清明显降低的IgE反应性。然而，最低的IgE结合力通常在突变体rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His的情况下观察到(图9)。此外，可以通过IgE抑制试验(EAST)检验根据本发明的重组变体与人IgE抗体的结合能力。在该方法中，可以在溶液中研究过敏原/IgE的相互作用，由此能排除例如由于固定于膜上导致的测试物质的表位的干扰屏蔽。在该实施例中，选择了在条带试验中通过其与突变体rPhl p 6 d[P29, 30] +6His的IgE结合力显著不同的两种草花粉过敏症患者的血清。血清P32代表在条带测试中仍然表现出可检测的与rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His的IgE结合的血清组(组“A”)，而选择血清P82作为不再具有可检测的反应性的血清组的代表(组“B”)(图9，图14)。用这种测试方法,可以验证相比于未修饰的rPhl p 6 wt + 6His,突变体rPhl ρ6 d[P29, 30] + 6His、rPhl p 6 d[P57] + 6His 和 rPhl p 6 d[P79] + 6His 的降低的 IgE结合力，与条带测试的结果一致(图10)。因此，条带测试方法的结果不可归因于IgE表位的部分屏蔽，而是正确地反映了溶解的蛋白质的降低的IgE结合能力。在使用血清P32的情况下，突变体rPhl p 6 d[P101] + 6His在整个浓度范围内表现出相当于野生型过敏原的IgE结合力(图10)。在使用血清P82时，仅仅在低蛋白浓度观察到低的IgE结合力，而在高浓度时IgE结合力再次相当于野生型过敏原的IgE结合力(图 10)。因此，通过脯氨酸残基101的缺失来降低Phl ρ 6的IgE结合能力在原则上也是可能的，但这种效果显然是如此小以至于它在条带测试方法中根本不能检测到和在IgE抑制试验中仅在低浓度时能检测到(图9，图10)。相反，突变体rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl ρ 6 d[P57] + 6His 和 rPhl ρ6 d[P79] + 6His的降低的IgE结合能力在条带测试中可以用大部分过敏症患者的血清轻易地检测到，并且在IgE抑制试验中在整个检测浓度范围内均被给出(图9，图10)。这基本上证明，第6组过敏原的脯氨酸6的缺失可以降低IgE结合能力。另一方面，只有某些脯氨酸的缺失导致相关的降低的IgE结合力。借助于用临床确定的草花粉过敏症患者的嗜碱性粒细胞的试验，可以在体外检测根据本发明的变体的降低的IgE结合能力对人效应细胞活化的作用。 测试中采用的粒细胞是由过敏症患者(在本例的过敏症患者P21)的全血分离的。该过敏症患者代表在条带试验方法中其IgE抗体表现出与rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His的可检测的结合力的这样的过敏症患者(组“A” ；图9，14)。在重组野生型过敏原和根据本发明的变体rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl ρ
6d[P57] + 6His和rPhl ρ 6 d[P79] + 6His相同浓度情况下，本发明的变体表现出对与膜结合的IgE抗体更低的结合力并因此导致嗜碱性粒细胞活化的急剧降低(图11)。因此该结果验证了突变体rPhlp 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl ρ 6 d[P57] + 6His和rPhl ρ 6 d[P79] + 6His的功能性降低的致敏性。因此该测试可以验证,至少在部分过敏症患者中，在Phl ρ 6的这两个区域中脯氨酸突变也降低了 IgE结合能力。因此本发明进一步提供脯氨酸单独突变的禾本科(Posceae)的第6组过敏原的低过敏性变体，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phl P 6的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。本发明优选提供脯氨酸单独突变的Phl ρ 6或Poa P 6的低过敏性变体，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phl ρ 6的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。本发明尤其优选提供脯氨酸单独突变的Phl ρ 6的低过敏性变体，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phl P 6的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。尤其优选的是脯氨酸去除突变的禾本科iPcmcime)的第6组过敏原的低过敏性变体，所述脯氨酸在比对中对应于成熟Phl ρ 6.0102 (SEQ ID NO: 2)的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。本发明进一步优选提供脯氨酸被单独去除的禾本科的第6组过敏原的低过敏性变体，所述脯氨酸根据本发明的在比对中对应于野生型Phl P 6的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸的。此外，本发明进一步提供根据本发明的脯氨酸被单独取代的禾本科iPcmcime)的第6组过敏原的低过敏性变体，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phl ρ 6的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。此处，脯氨酸被例如亮氨酸(L)替代。然而，根据本发明，根据本发明的脯氨酸可以被任何氨基酸替代。尤其地，低过敏性变体rPhlp 6 d[P29]、rPhl ρ 6 d[P30]、rPhl ρ 6 d[P29，30]、rPhl ρ 6 d[P57]、rPhl ρ 6 d[P79]、rPhl ρ 6 P29L、rPhl ρ 6 P30L、rPhl ρ 6 P29L，P30L、rPhl ρ 6 P57L和rPhl ρ 6 P79L以及类似的，包括所有下文所述的根据本发明的低过敏性变体均是根据本发明的，其中遵循Phl ρ 6、尤其是成熟Phl ρ 6. 0102的序列的编号。而且，这些例子并不限于Phl ρ 6的变体，而是尤其也涉及所有其它禾本科的PoaP 6和第6组过敏原。此外，根据本发明的第6组过敏原的低过敏性变体仍可检测的IgE结合能力可通过脯氨酸突变进一步降低。因此，由于突变体rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His强烈降低的IgE结合力以及通过脯氨酸57和79缺失可以降低IgE结合能力的事实，产生包含组合突变的核酸。基于突变体rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His的DNA，57和79位的脯氨酸缺失或被转换
为氨基酸亮氨酸。于此相应的，制备编码蛋白质rPhl ρ 6 d[P29, 30, 57] + 6His和rPhl p 6d[P29, 30, 79] + 6His 以及rPhl ρ 6 d[P29, 30] P57L + 6His和rPhl ρ 6 d[P29, 30] P79L + 6His的序列。这些变体编码在与Phl ρ 6的α-螺旋连接的环的两个中携带脯氨酸突变的蛋白(图2)。此外，制备编码rPhl ρ 6 d[P29, 30] P57L P79L + 6His的核酸，以产生在三个环区域中具有脯氨酸突变的过敏原变体(图2)。如上所述，优选在大肠杆菌中表达所述序列，并且通过标准方法纯化所述蛋白质。同样通过SDS-PAGE和通过SEC/MALS/RI检测纯度(图12，图13)。因此根据本发明的所有蛋白质均可以以高纯度和溶解度制备。SEC/MALS/RI方法揭示了上述突变体在形成二聚体方面的显著差异(图13，表2)。蛋白质 rPhl ρ 6 d[P29, 30, 57] + 6His、rPhl ρ 6 d[P29, 30] P57L + 6His 和 rPhl ρ 6d[P29, 30] P57L P79L + 6His的测定的分子量表现出形成二聚体的明显倾向。蛋白质rPhlP 6 d[P29, 30, 79] + 6His 和 rPhl p 6 d[P29, 30] P79L + 6His 仅以单体形式被检测到(表2)。从该结果可以得出结论，脯氨酸57但不是脯氨酸79的改变诱导二聚体倾向地改变了 rPhl ρ 6 d[P29,30]。通过条带测试测定IgE结合能力确实令人惊讶地表明，组“A”的过敏症患者的对rPhl ρ 6 d[P29, 30]具有可检测的IgE结合力的血清对优化的变体具有明显降低的IgE结合力(图14)。脯氨酸57和79是否缺失或被其它氨基酸替换显然同样对IgE结合能力的降低具有很小的影响，如同形成二聚体能力一般。因此证实，来自脯氨酸29、30、57和79的组的多个氨基酸残基同时具有改变进一步明显降低了 IgE结合力。因此本发明进一步提供脯氨酸组合突变的禾本科家族的第6组过敏原的低过敏性变体，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phl ρ 6的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。优选的是通过缺失和通过被其它氨基酸的取代的突变。任何氨基酸都可以在此处被选择用于替代脯氨酸。本发明优选提供脯氨酸组合突变的Phl ρ 6或Poa P 6的低过敏性变体，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phl ρ 6的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。本发明尤其优选提供脯氨酸组合突变的Phl ρ 6的低过敏性变体，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phl P 6的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。尤其优选的是脯氨酸组合突变的禾本科iPoaceae)的第6组过敏原的低过敏性变体，所述脯氨酸在比对中对应于成熟Phl ρ 6.0102 (SEQ ID NO: 2)的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。尤其优选的是根据本发明的低过敏性变体，其中脯氨酸29、30、57、79被组合去除。尤其优选的还是根据本发明的过敏原变体，其中脯氨酸29、30、57、79被组合取代。此外，尤其优选的是根据本发明的低过敏性变体，其中脯氨酸29、30、57、79被组合去除和/或取代。因此，根据本发明的尤其是低过敏性变体rPhl ρ 6 d[P29，30，57]、rPhlP 6 d[29, 30，79]、rPhl ρ 6 d[29, 30，57，79]、rPhl ρ 6 d[P29, 57]、rPhl p 6 d[P30，57]、rPhl p 6 d[29, 79]、rPhl p 6 d[30, 79]、rPhl p 6 d[29, 57，79]、rPhl p 6 d[30，57，79]、rPhl p 6 d[P29, 30] P57L、rPhl p 6 d[29, 30] P79L、rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L、rPhlp 6 d[P29] P30L、rPhl p 6 d[P30] P29L、rPhl p 6 d[P57] P29L P30L、rPhl p 6 d[P79]P29L P30L、rPhl p 6 d[P57，79] P29L P30L、rPhl p 6 P29L P30L P57L、rPhl p 6 P29LP30L P79L、rPhl p 6 P29L P30L P57L P79L以及类似物，包括所有下述的根据本发明的低过敏性变体，其中遵循Phl ρ 6、尤其是成熟Phl ρ 6.0102的序列的编号。
此处，脯氨酸被例如亮氨酸(L)替代。然而，根据本发明，根据本发明的脯氨酸可以被任何氨基酸替代。因此，根据本发明的是所有上面提到的低过敏性变体，在其中根据本发明的一个或多个的脯氨酸被另一种氨基酸取代。此外，这些例子并不限于Phl ρ 6的变体，而是尤其也涉及所有其它禾本科的Poa ρ 6和第6组过敏原。然而，尤其优选的是所有提到的根据本发明的梯牧草/Traiefl1Si )游Phl ρ 6、尤其基于Phl ρ 6. 0102的低过敏性变体。辅助性T淋巴细胞反应与通过在抗原呈递细胞(APZ)中的降解过程形成并被递呈结合于APZ表面的MHC II类分子的过敏原的肽片段反应。所述肽一般具有13-18个氨基酸的长度，但由于侧向开放的MHC 2类结合位点也可能更长。肽与MHC类分子的主要接触点被发现在约7-10个氨基酸的核心序列中。辅助性T淋巴细胞的过敏原特异性活化是其增殖和功能分化的先决条件(例如Treg、THl和Th2)。过敏原或过敏原变体刺激过敏原特异性T淋巴细胞的能力被视为其疗效的关键。基于Phl ρ 6或Phl ρ 6. 0102产生和此处所述的所有过敏原变体在实验中均表现出重要的T细胞表位的很大程度的保留。因此，首次描述了通过脯氨酸残基的改变具有新的蛋白质特性的禾本科的第6组过敏原的变体。涉及的脯氨酸残基位于环区域。仅修饰某些脯氨酸残基产生新的变体，其特征在于很大程度地保留T细胞反应性的同时IgE反应性降低，并因此适用于治疗和预防特异性免疫治疗法。相应的DNA分子适用于免疫性治疗的接种。因此，本发明提供所述的根据本发明的过敏原变体、DNA分子和重组表达载体作为药物。尤其可以使用根据本发明的低过敏性变体、DNA分子和重组表达载体或根据本发明的药物用于疾病和病症的预防和/或治疗。根据本发明的药物尤其适用于I型过敏症的治疗和/或预防，即用于具有草花粉过敏的患者的特异性免疫治疗(脱敏)或用于在涉及禾本科种G0Oaceae species)的第6组的过敏原触发的草花粉过敏症的预防性免疫治疗。根据本发明的DNA分子和重组表达载体可用于相应的免疫治疗和预防性预防的DNA接种。本发明还提供至少一种根据本发明的低过敏性变体用于制备用于预防和/或治疗处理禾本科的第6组的过敏原参与成因引发的I型过敏症的药物的用途。至少一种根据本发明的DNA分子和/或根据本发明的重组表达载体，包括其以所有比例的混合物用于制备用于免疫治疗性DNA接种的药物的用途也是根据本发明的。本发明还涉及药物制剂，包括至少一种本发明的低过敏性的变体、至少一种本发明的DNA分子和/或至少一种本发明的重组表达载体，包括其所有比例的混合物，以及任选的进一步的用于预防和/或治疗性治疗I型过敏症的活性物质和/或助剂。根据本发明的药物制剂尤其适用于预防和/或治疗性处理由禾本科的第6组的过敏原参与成因引发的I型过敏症。在本发明范围内的药物制剂可作为治疗剂在人用药或兽药中使用，并因此可以相应地被给药于人和动物，尤其是哺乳动物，如猴、狗、猫、大鼠或小鼠，并可被用于人或动物体的治疗性处理并用于对抗上述疾病。此外，他们可以被用作诊断剂或作为试剂。
在使用根据本发明的制剂或药物时，将根据本发明的低过敏性变体、DNA分子或重组表达载体类似于通常已知的商业可得的制剂或配制品使用，优选剂量O. 001-500 mg，在低过敏性变体的情况中在维持期中每剂量约1-500 Pg，优选5-200 Pg。制剂给药可以每天一次或多次，例如，每天两次、三次或四次。通常在剂量增加阶段增加剂量至最高到维持剂量。为此，不同的剂量增加和维持方案是可能的。在皮下免疫治疗(SCIT)的情况下，例如，这些可以包括短期治疗(在季节性疾病开始前有限数量的注射，通常为4 - 7次注射)、季节前治疗(在草花粉季节前开始治疗，通常在增加阶段每周注射，以维持剂量每月注射直到草花粉季节开始)或全年治疗(剂量增加阶段通常每周注射一次最多16次，随后以维持剂量每月注射一次，如有需要，在花粉季节减少剂量)。在用含水的或固体制剂(片剂、糯米纸囊剂等)的舌下免疫治疗的情况下，治疗的开始可以有或没有增加剂量阶段地进行。该治疗优选全年以每日剂量进行，但也可以在季节前或以其它应用方案(例如每两天、每周、每月)进行。表述“有效量”是指，其例如为研究者或医生找寻或力求的，在组织、体系、动物或人中引起生物学的或医学应答的药物或药物活性物质的量。此外，表述“治疗有效量”是指，与未获得该剂量的相应患者相比，具有以下的结果的剂量疾病、病症、疾病状态、疾患、不适的改善的治疗处理、康复、预防或消除，或者防治副作用，亦或者疾病、疾患或不适的进展的减缓。术语“治疗有效量”也包含有效地增加正常生理功能的量。可以调整药物以通过任何合适的途径给药，例如以口服(包括口腔的或舌下的)、直肠的、肺部的、鼻的、局部的(包括口腔的、舌下的或经皮的)、阴道的或胃肠外的(包括皮下的、肌肉的、静脉内的或皮肤内的)途径。这些药物可以用药学专业领域已知的所有方法，例如通过活性物质与一种或多种赋形剂或一种或多种助剂相结合来制备。用作肠胃外应用的尤其是溶液，优选油性或水性溶液，还可以是悬浮液、乳液或植入物。根据本发明的过敏原变体也可以冻干，且获得的冻干物，例如用于制备注射制剂。指定的制剂可被灭菌和/或包含助剂，如润滑剂、防腐剂、稳定剂和/或润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲物质和/或多种其它活性物质。此外，可以通过相应的根据本发明的过敏原变体的配方，例如通过吸附至氢氧化铝、磷酸三钙或酪氨酸上获得缓释剂。合适的赋形剂是有机或无机物质，其适用于肠胃外给药，并且不与根据本发明的第6组过敏原变体反应。其例子为赋形剂，如水、植物油、苄醇、聚乙二醇、三醋酸甘油酯、明胶、碳水化合物、如乳糖或淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、羊毛脂或凡士林。肠胃外给药优选适用于根据本发明的药物的给药。在肠胃外给药的情况下，尤其优选的是静脉内的、皮下的、皮内的或淋巴管内给药。在静脉给药的情况下，注射可以直接进行或作为输液的添加物进行。适合于肠胃外给药的药物包括水性和非水性的无菌注射溶液，其包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和增溶剂(通过其使得配剂与待治疗的受体的血液等渗)，以及水性的和非水性的无菌悬浮液(其可包括悬浮剂和增稠剂)。所述配剂可以在单剂量或多剂量容器中给药，例如密封的安瓿和小瓶，并储存在冷冻干燥(冻干)状态，这样仅需要在临使用前添加无菌赋形溶液例如水，用于注射目的。根据配方制备的注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。如果希望，根据本发明的制剂或药物可以包含一种或多种其它活性物质和/或一 种或多种作用增强剂(Wirkverstjirker)(佐剂)。因此，本发明进一步提供药物制剂，其包含其它活性物质和/或助剂。本发明优选提供根据本发明的药物制剂，其特征在于，所述其它活性物质是其过敏原或其变体。合适的其它活性物质的例子是其它过敏原，尤其是禾本科的过敏原，尤其优选来自早熟禾亚科(Pooideae)亚科的过敏原,优选来自早熟禾超族(Poodae)和Triticodae组,优选通过猫尾草(Phleum pratense)、绒毛草(Holcus lanatus)、水生薦(Phalaris aquatica)、鸭茅(Dactylis glomerata)、黑麦草(Lolium perenne)、草地早熟禾(Poa pratensis)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereale)和小麦(Triticum aestivum)代表，例如第 I、
2、3、4、5、6、7、10、12或13组的过敏原及其变体，例如低过敏性变体、片段、多聚体、杂合分子或重组融合蛋白。而且，本发明还提供药物制剂，其包含至少一种其它助剂，尤其优选所谓的作用增强剂。作用增强剂的例子为氢氧化铝、单磷酰脂A、Toll样受体激活剂，例如，月旨多糖和CpG寡核苷酸、维生素D3、分枝杆菌抗原和来自寄生虫(如血吸虫或丝虫)的分子，例如，胱抑素或ES-62。本发明也提供由以下独立包装组成的套件(试剂盒)
a)根据本发明的药物制剂，其包含根据本发明的低过敏性的变体、DNA分子或重组表达载体的有效量
b)药物制剂，其包含其它药学活性物质和/或作用增强剂的有效量。该套件包含合适的容器，如盒子或纸箱、单独的瓶、袋或安瓿。该套件可包含例如独立的安瓿，在所述安瓿中根据本发明的配剂各以溶解形式或以冻干形式存在，所述配剂包含根据本发明的低过敏性的变体、DNA分子或重组表达载体和其它药物活性物质的配剂的有效量。甚至没有进一步的实施方式也被认为，本领域技术人员能够在最宽范围内利用上面的说明。因此，优选的实施方式仅仅被视为说明性公开，但绝不应理解为以任何方式来限制的公开。因此，下列实施例应当解释本发明，而非对其进行限制。除非另有说明，百分比数据是指重量百分比。所有温度都是摄氏度表示。“常规后处理”:如有必要，加水，如有必要，根据最终产物的构成，将pH值调整至2-10之间。
通过生物技术方法制备并表征以下的根据本发明的低过敏性变体。然而，所述物质的制备和表征也可以用本领域技术人员已知的其他方法实施。例如，也可以化学合成本发明的低过敏性变体。本发明同样提供下面所述的根据本发明的低过敏性变体。实施例I :在一个单个的环区域中具有脯氨酸缺失的Phl ρ 6的变体
如下所述制备变体rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl ρ 6 d[P57] + 6His和rPhl ρ 6d[P79] + 6His并对其进行免疫学表征。类似地，制备并检测重组的未改变的过敏原(rPhlP 6 wt + 6His)，且类似地，也可以制备并检测其它的根据本发明的禾本科的第6组过敏原的低过敏性变体及其野生型蛋白质，尤其是Poa ρ 6。基因工程的构建
通过长的重叠的DNA寡核苷酸的结合以及通过PCR标准方法的DNA扩增合成编码变体的DNA。如此选择密码子，然后通过RI检测器确定颗粒的浓度，用MALS检测器记录颗粒的光散射(Wen等，1996，Anal. Biochem. 240:155-166)。由这些数据以约5%的精确度计算 洗脱颗粒的平均质量。可以通过SEC/MALS/RI证实单体、二聚体、其它多聚体和聚集物。在SEC/ MALS/ RI分析中，变得清晰的是，分别在各个峰中洗脱的蛋白质在天然条件下作为纯单体存在(图8，表I)。表I : Phl ρ 6野生型和在环1、2、3或4中具有脯氨酸缺失的Phl ρ 6变体的分
子量
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1基于具有起始甲硫氨酸的氨基酸序列估算的分子量(软件EditSeq 6.0; DNA-StarInc. , Madison, USA)。
2通过凝胶过滤(SEC)测定粒子质量。给出的是在标定的峰窗口中洗脱的蛋白颗粒的平均质量。使用折射率检测器(RI)OptilabrEX(Wyatt, Santa Barbara,USA)用于蛋白质浓度的在线测定。用多角度检测器MiniDAWN Treos (Wyatt)测定颗粒的光散射。用软件ASTRA5. 3. 2. 17 (Wyatt)通过具有O. 180 ml/ g的假设折光指数增量的Debeye形式进行颗粒质量的计算。SEC 柱Superdex 200 GL 10/ 300 (GE Healthcare, Uppsala,瑞典)。洗脱液含有150 mM氯化钠的20 mM磷酸钠缓冲液，pH 7. 2。推导的氨基酸序列基于成熟的Phl ρ 6.0102 (图3，图4)。通过在PCR反应中使用缺乏相应的脯氨酸密码子的特异性寡核苷酸引入脯氨酸缺失的突变。如此选择这些寡核苷酸，使得推导的蛋白质在5’末端携带一个六-组氨酸-融合部分(图5，图6)。通过拓扑异构酶反应将这些DNA片段连接在表达载体pTrcHis2 Topo(Invitrogen, Carlsbad, USA)中。通过测序验证DNA的正确性。表达和纯化
在大肠杆菌coli )(菌株ToplO; Invitrogen)中进行重组组氨酸融合蛋白的表达。通过N-末端组氨酸残基与Ni2+螯合基质(固定化金属离子亲和色谱，IMAC ；材料HiTrap, GE Healthcare, Uppsala,瑞典)的特异性结合首先纯化rPhl p 6 wt + 6His和变体。随后浓缩得自IMAC洗脱物的重组蛋白，并进行凝胶过滤(材料=Superdex 75;GE Healthcare)。生化分析
首先通过SDS-PAGE及随后的考马斯染色检查制备的蛋白质的纯度。该分析显示了所 有蛋白质的非常高的纯度(图7)。分析凝胶过滤(SEC)允许根据蛋白质种类特定的水动力学半径分离蛋白质种类。通过将折射仪(RI检测器)和多角度光散射检测器(MALS探测器)偶联至色谱系统可以实现分子量的在线测定(SEC/MALS/RI方法)。在该方法中，给定测定时间。也通过UV-Vis光谱检查不溶性蛋白质团聚物的缺乏(光度计=Ultrospec5300pro UV/VIS; GE Healthcare)。在UV-Vis光谱中，在240-800 nm波长范围内记录蛋白质溶液的波谱。蛋白质溶液中的不溶性团聚物吸收>300 nm范围的波长，而高可溶性的蛋白质在此范围不吸收。该波谱对于具有高溶解度的蛋白质是典型的。因此，根据本发明的蛋白质在天然条件下是可溶的、高纯度的和单体。降低的IgE结合力的证据
用于确定过敏症患者血清的特异性IgE的反应性的简单测试方法是条带检测。用这种方法,可以同时检测较大数量的过敏症患者血清。为此，将测试物质以相同的浓度和量在非变性条件下彼此相邻地结合于硝酸纤维素膜条带上。可以将一系列这样的膜条带同时与不同的过敏症患者血清进行温育。洗涤步骤后，通过抗人IgE /碱性磷酸酶偶联物促进的颜色反应使特异性结合的IgE抗体在膜上变得可见。分别使用18份草花粉过敏症患者血清与Phl ρ 6变体的结果显示在图9中。作为重要的对照，首先检测有和没有组氨酸融合部分的重组过敏原的IgE结合力。两种蛋白质都表现出相同的IgE结合能力。因此，用于研究的N-末端组氨酸融合部分不干扰IgE与Phl ρ 6的结合。如未修饰的过敏原一般，突变体rPhl ρ 6 d[P101] + 6His与所有被测试的血清均表现出相似良好的IgE结合力(图9)。由此得出，脯氨酸101的缺失对Phl ρ 6的IgE结合能力没有显著影响。突变体rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl ρ 6 d[P57] + 6His和rPhl ρ 6 d[P79] + 6His的IgE结合力在不同的草花粉过敏症患者的血清中差别非常显著。这是由各过敏症患者的IgE群体组成的IgE抗体的亲和力和表位特异性的变化而产生。相比于未修饰的rPhl ρ 6 wt + 6His,突变体 rPhl p 6 d[P57] + 6His 和 rPhl ρ 6d[P79] + 6His显示出与大部分血清明显降低的IgE反应性。然而，最低的IgE结合力通常在突变体rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His的情况下观察到(图9)。用EAST抑制测试(酶变应原吸附剂测试(Enzyme Allergosorbent Test))进行溶解的测试物质的IgE结合能力的检测。在该方法中，可以在溶液中研究过敏原/IgE的相互作用，以此能排除例如由于固定于膜上导致的测试物质的表位的干扰屏蔽。如下进行EAST抑制测试。用过敏原,此处为rPhl p 6 wt + 6His涂覆微滴定板。通过洗涤去除未结合的过敏原分子后，用牛血清白蛋白封闭该板以防止以后的非特异性结合。将过敏症患者的IgE抗体作为适当稀释的单独的血清用经过敏原涂覆的微滴定板温育。经由抗hIgG/碱性磷酸酶偶联物通过底物的反应产生显色的最终产物以光度计定量过敏原结合的IgE抗体的量。取决于浓度，通过可溶性过敏原或待测试的底物(重组的修饰的过敏原)使IgE抗体的结合底物特异性地被抑制。
在图10中所示的与Phl ρ 6的重组过敏原变体的IgE抑制试验结果显示，由脯氨酸残基P[29，30]、P57和P79的缺失导致了 Phl ρ 6的IgE结合能力的降低。在这种情况中，突变体d[P29, 30]的IgE结合能力显著低于d[P57]或d[P79]的IgE结合能力。较低的抑制作用表明IgE表位的损失。突变体d[P101]显示用草花粉过敏症患者P32的血清没有改变IgE结合力，和用血清P82仅很少地改变了结合力，这再次与野生型在高浓度的情况接近。功能性致敏性降低的证明
随后在体外检测在效应细胞的膜结合的IgE交联时突变体的功能作用及其激活。将草花粉过敏症患者的肝素化的全血与不同浓度的测试物质温育用于嗜碱性粒细胞活化试验。这里，致敏物质能够结合特异性IgE抗体，所述抗体结合了高亲和力的嗜碱性粒细胞的IgE受体。通过过敏原分子触发的IgE/受体复合物的交联导致信号转导，这导致效应细胞的脱颗粒化并因此触发体内的过敏反应。可以通过用IgE受体交联偶联的表面蛋白(⑶203c)的信号转导表达的定量化证明嗜碱性免疫细胞的过敏原诱导的活化(Kahlert等，Clinical Immunology and Allergyin Medicine Proceedings of the EAACI 2002 (2003) Naples,意大利 739-744)。通过突光标记的单克隆抗体与表面蛋白的结合以及随后的通过荧光激活的流式细胞仪的分析高度灵敏地测定在细胞上表达的表面蛋白的数量和细胞池的活化细胞的百分比值。在本实施例中，本测试中采用的粒细胞由过敏症患者P21的全血中分离。该过敏症患者代表在条带试验方法中其IgE抗体表现出与rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His的可检测的结合的这样的过敏症患者(组“A”)。在未修饰的重组过敏原和rPhl ρ 6 d[P29, 30]+ 6His的浓度相同时，在两个供体的情况下后者表现出对与膜结合的IgE抗体更低的结合力并因此导致嗜碱性粒细胞的活化急剧降低(图11)。因此该结果验证了突变体rPhl ρ 6 d[P29, 30] + 6His的功能性降低的致敏性。在供体P21的情况下，突变体rPhl ρ 6 d[P57] + 6His和rPhl p 6 d[P79] + 6His清楚显示出嗜碱性细胞活化的降低。因此用该测试可以验证，至少在部分过敏症患者中，在PhlP 6的这两个区域中脯氨酸突变也降低了 IgE结合能力。变体的T细胞反应性为了检测T细胞的反应性，在未修饰的过敏原刺激下根据常规方法建立草花粉过敏症患者的寡克隆的T细胞系。在增殖试验中，将不同的T细胞系用参照过敏原rPhl P 6 Wt以及修饰的重组过敏原变体刺激。通过[3H]胸腺嘧啶的嵌入用常规方法测定增殖率。变体rPhlp 6 d[P29, 30] + 6His、rPhl ρ 6 d[P57] + 6His和rPhl ρ 6 d[P79]+ 6His刺激被研究的T细胞系以与由未修饰的过敏原的刺激可比较的程度增殖。由此可以进行重要的T细胞表位的保留。实施例2 在多个环区域中具有脯氨酸缺失组合的Phl ρ 6的变体
下面描述了变体 rPhl ρ 6 d[P29, 30, 57] + 6His 和 rPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6His的制备和免疫学表征，作为对应于Phl ρ 6野生型的氨基酸位置(IUIS条目Phl ρ 6.0102)29，30; 57和79的禾本科的第6组过敏原的低过敏性变体与脯氨酸缺失组合 的例子。这里，缺失的脯氨酸残基可以位于与Phl ρ 6同源的两个或三个环区域中。类似地，制备并检测 Phl ρ 6 野生型异构体Phl ρ 6. 0101 (GenBank:Z27082. I,UniProt :P43215)的相应的低过敏性变体，并且也可以制备并检测其它根据本发明的禾本科的第6组过敏原的低过敏性变体及其野生型蛋白质、尤其是Poa ρ 6的。如此选择密码子，使得推导的氨基酸序列基于成熟的Phl ρ 6. 0102 (图3，图4)。通过在PCR反应中使用缺乏相应的脯氨酸密码子的特异性寡核苷酸引入脯氨酸缺失的突变。优选如此选择这些寡核苷酸，使得推导的蛋白质在5’末端携带一个六-组氨酸-融合部分(图5，图6)。通过拓扑异构酶反应将这些DNA连接进表达载体pTrcHis2 Topo(Invitrogen, Carlsbad,USA)。通过测序验证DNA的正确性。然而，也可以使用其它常用的表达载体。通过在PCR反应中使用缺乏相应的脯氨酸密码子的特异性寡核苷酸引入脯氨酸缺失的突变。可以在所有常用的真核和原核表达体系中进行重组组氨酸融合蛋白的表达，优选在大肠杆菌(AscAericAia co7i)(菌株ToplO; Invitrogen)中进行表达。通过N-末端组氨酸残基与Ni2+-螯合-基质(固定化金属离子亲和色谱，IMAC 4·^|4:Η ΤΓ&ρ，6Ε Healthcare,Uppsala，瑞典)的特异性结合首先纯化变体。随后浓缩得自IMAC洗脱物的重组蛋白，并进行凝胶过滤(材料Superdex 75; GE Healthcare)。生化分析
首先通过SDS-PAGE及随后的考马斯染色检查制备的蛋白质的纯度。分析显示出所有蛋白质的非常高的纯度(图12)。在天然条件下检测蛋白质的分析SEC表明了，蛋白质在一个单峰中洗脱。未检出高分子量团聚体(图13)。通过MALS/ RI的在线测定分子量产生的结果为rPhl ρ 6d[29, 30, 79] + 6His以纯单体存在，而洗脱的rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His是单体和二聚体的混合物(图13 ;表2)。然而，UV-Vis光谱记录的两种蛋白质的波谱对于高溶解度的蛋白质而言是典型的。因此，两种蛋白质在天然条件下是可溶的、纯的且没有沉淀，并因此满足了精确分析其特异性IgE结合能力的根本的先决条件。表2:在多个环区域中具有突变的Phl ρ 6的突变体的分子量
权利要求
1.禾本科iPoaceae)的第6组过敏原的低过敏性变体，其中脯氨酸单独或组合突变，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phl P 6的氨基酸序列中位置29、30、57、79的脯氨酸。
2.根据权利要求I所述的低过敏性变体，其特征在于，所述第6组过敏原是PhlP 6。
3.根据权利要求I或2所述的低过敏性变体，其特征在于，它是根据权利要求I或2所述的低过敏性变体的片段或变体，或是一种或多种根据权利要求I或2所述的低过敏性变体的多聚体，或者其特征在于，一种或多种根据权利要求I或2所述的低过敏性变体或其片段、变体或多聚体是重组融合蛋白的组成部分。
4.DNA分子，其编码根据权利要求1-3的一项或多项的低过敏性变体。
5.重组表达载体，其包含与表达调控序列功能性连接的根据权利要求4的DNA分子。
6.非人宿主生物，以根据权利要求4的DNA分子或根据权利要求5的重组表达载体转化。
7.通过培养根据权利要求6的非人宿主生物并由培养物分离相应的过敏原变体来制备根据权利要求1-3的一项或多项的低过敏性变体的方法。
8.根据权利要求1-3的一项或多项的低过敏性变体，作为药物。
9.根据权利要求4的DNA分子，作为药物。
10.根据权利要求5的重组表达载体，作为药物。
11.至少一种权利要求1-3的一项或多项的低过敏性变体用于制备用于预防和/或治疗性处理禾本科的第6组过敏原参与成因引发的I型过敏症的药物的用途。
12.至少一种根据权利要求4的DNA分子和/或根据权利要求5的重组表达载体用于制备用于免疫治疗性DNA接种的药物的用途。
13.用于预防和/或治疗性处理I型过敏症的药物制剂，包括至少一种根据权利要求1-3的一项或多项的低过敏性的变体、至少一种根据权利要求4的DNA分子和/或至少一种根据权利要求5的重组表达载体和任选的其它的活性物质和/或助剂。
14.权利要求13的药物制剂，其特征在于，所述其它活性物质是禾本科的过敏原或其变体。
全文摘要
本发明涉及禾本科(Poaceae)第6组过敏原的重组变异体的制备和用途，其特征在于相对于已知的野生型过敏原的降低的IgE反应性以及同时很大程度地保持了与T淋巴细胞的反应性。
文档编号C07K14/415GK102811735SQ201080061391
公开日2012年12月5日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年1月14日
发明者M.瓦尔德, A.南迪, H.菲比希, B.韦伯, H.卡勒特, G.雷泽, O.克龙威尔 申请人:默克专利股份公司