在原核细胞中产生免疫原性多糖的生物合成系统的制作方法

专利名称：在原核细胞中产生免疫原性多糖的生物合成系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物合成系统和蛋白质在制备疫苗中的应用。另外，本发明涉及重组原核生物合成系统，该系统具有启动在还原末端具有特定单糖的寡糖或多糖(oligo-or polysaccharide)的合成的差向异构酶。本发明还涉及在表达系统中用聚糖产生的N-糖基化蛋白及由包含免疫原性聚糖的所述N-糖基化蛋白制成的生物缀合物疫苗(bioconjugate vaccines),并且提供用于产生N-糖基化蛋白的方法。发明背景 糖蛋白是具有一个或多个共价连接的糖聚合体的蛋白质。N-联蛋白质糖基化是在真核生物的内质网中发生的一种必需和保守的过程。它对于分泌蛋白和膜蛋白的蛋白质折叠、寡聚化、稳定性、质量控制、分选(sorting)和转运来说是十分重要的(Helenius，A.和Aebi, M. (2004). Roles of N-Iinked glycans in the endoplasmic reticulum (N_ 联聚糖在内质网中的作用) Annu. Rev. Biochem. 73, 1019-1049)。蛋白质糖基化对于蛋白质的免疫原性、稳定性和半寿期具有深远的影响。另外，糖基化可有助于蛋白质的纯化，即利用与固相结合并与蛋白质的糖基化部分相互作用的凝集素配体进行层析(例如亲和层析)来纯化蛋白质。因此，为了提供生物学和药学上有用的糖基化模式，惯例是在真核细胞中重组产生许多糖基化蛋白。WO 2003/07467 (Aebi等人)证明了经食物传播的病原体空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(它是一种细菌)可以使其蛋白质N-糖基化，除了古生菌(archaea)的某些种以外，在已知的原核生物中，这是一种独特的特征。糖基化所需要的机器由12个基因编码，这12个基因在所谓的pgl基因座中是成簇的。N-糖基化的破坏会影响空肠弯曲杆菌(C. jejuni)的侵袭和致病机制但并不是致死的，正如在大多数真核生物中(Burda P.和 M. Aebi, (1999). The dolichol pathway of N-Iinked glycosylation(N-联糖基化的多職醇途径).Biochem Biophys Acta 1426 (2) : 239-57)。在大肠杆菌(E. coli)中通过同时重组表达Pgl基因座和受体糖蛋白来重建空肠弯曲杆菌蛋白的N-糖基化是可倉泛的(Wacker 等人(2002). N-Iinked glycosylation in Campylobacter jejuni and itsfunctional transfer into E. coli (空肠弯曲杆菌中的N-联糖基化及其功能性转移到大肠杆菌中) Science 298，1790-1793)。N-聚糖具有一种与蛋白质中的共有序列连接的聚糖。蛋白质中已知的N-糖基化共有序列允许原核生物中重组靶蛋白的N-糖基化。这类生物体包含寡糖基转移酶(“0T”； “OTase”)，例如空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶，寡糖基转移酶是一种将聚糖转移到蛋白质的共有序列上的酶。WO 2003/07467 (Aebi等人)教导了一种被导入了编码以下⑴、(ii)和(iii)的核酸的原核生物(i)在脂质载体上装配寡糖的特定糖基转移酶，(ii)包含共有序列“N-X-S/T”的重组靶蛋白，其中X可以为除脯氨酸以外的任何氨基酸，和(iii)寡糖基转移酶，例如将所述寡糖与靶蛋白的共有序列共价连接的空肠弯曲杆菌寡糖基转移酶。所述原核生物产生具有由特定糖基转移酶类型限定的特定结构的N-聚糖。WO 2006/119987 (Aebi等人)描述了用于在原核生物体内(in vivo)高效N-糖基化的蛋白质，以及高效产生N-糖基化蛋白质的手段(means)和方法。它进一步描述了将N-聚糖有效引入到重组蛋白中以改变所述蛋白的免疫原性、稳定性、生物活性、预防和/或治疗活性，并且提供了在其表面有效地展示本发明的重组N-糖基化蛋白的宿主细胞。另夕卜，它描述了一种重组N-糖基化蛋白，其包含以下N-糖基化最优化氨基酸序列中的一个或多个 D/E-X-N-Z-S/T (最优化共有序列)，其中X和Z可以为除Pro以外的任何天然氨基酸，并且其中所述N-糖基化部分氨基酸序列中的至少一个被引入。将特定部分氨基酸序列(最优化共有序列)引入到蛋白质 会导致产生在这些引入的位置中被寡糖基转移酶有效地N-糖基化的蛋白质。不同多糖的生物合成在细菌细胞中是保守的。多糖在载体脂质(carrier lipid)上从细胞质膜上的共同前体(活化糖核苷酸)由具有确定特异性的不同糖基转移酶进行装配。脂多糖(“LPS”)仅在革兰氏阴性菌例如志贺氏菌(Shigella spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和大肠杆菌(E. coli) (ExPEC, EHEC)中提供。LPS的合成始于在膜的细胞质一侧将单糖添加到载体脂质i^一异戊二烯基磷酸(undecaprenyl phosphate, “Und-P-P”)上。通过不同糖基转移酶序贯添加来自活化糖核苷酸的单糖构建抗原，而脂质-连接的多糖通过翻转酶(flippase)穿过膜转向。抗原-重复单位通过酶反应进行聚合。然后多糖通过连接酶(Ligase) WaaL转移到脂质A，形成LPS，再输出到表面，而荚膜多糖在聚合后从载体脂质中释放出来并输出到表面。这些多糖的生物合成途径使得LPS生物缀合物能够在体内(in vivo)产生，俘获周质中的多糖到蛋白载体。寡糖或多糖(即糖残基)和蛋白(即蛋白载体)的这类合成复合物可以用作缀合物疫苗以抵抗多种细菌感染。缀合物疫苗已经成功地用于抵抗细菌感染。抗原性多糖与蛋白载体的缀合需要保护性记忆应答，因为多糖是不依赖T-细胞的免疫原。利用多糖以及蛋白载体中的活化反应基团，通过不同的化学方法已经使多糖与蛋白载体缀合。缀合物疫苗可以给予儿童以抵抗细菌感染并且也可以给成年人提供长时间持续的免疫应答。WO 2009/104074 (Fernandez等人)的构建体已经发现在动物中产生IgG应答。在人类中，已经发现针对志贺氏菌属0-特异性多糖-蛋白缀合物疫苗的IgG应答与人体内的免疫保护有关(PasswelI, J. H.等人，“Safety and Immunogenicity of ImprovedShigella 0-Specific Polysaccharide-Protein Conjugate Vaccines in Adults inIsrael (改进的志贺氏菌属0-特异性多糖-蛋白缀合物疫苗在以色列成年人中的安全性和免疫原性)’’Infection and Immunity, 69 (3) : 1351-1357 (2001 年 3 月))。据信多糖(即糖残基)触发糖特异性的短期免疫应答。事实上，人体的免疫系统对细菌的特定多糖表面结构例如0-抗原和荚膜多糖会产生强烈应答。然而，由于对多糖的免疫应答是依赖IgM的，因此免疫系统不产生记忆。携带多糖的蛋白载体能触发IgG应答，IgG应答是依赖T-细胞的并提供长时间持续的保护作用，因为免疫系统产生了记忆。大肠杆菌0157是一种引起溶血性尿毒综合征所有当前病例三分之二左右的肠出血性菌株并造成严重的人类健康担忧(Law, D. (2000) J. App.Microbiol. , 88, 729-745; Wang, L.和 Reeves, P. R. (1998) Infect. Tmmun. 66, 3545-3551)。大肠杆菌菌株0157 (Escherichia coli strain 0157)产生含有重复四糖单兀(4-N-乙酸基 perosamine —岩藻糖—葡萄糖—GalNAc) ( a -D-PerNAc- a -L-Fuc- ^ -D-GIc-a-D-GalNAc)的 0_ 抗原(Perry, M. B. , MacLean, L.和 Griffith, D. W. (1986) Biochem.Cell. Biol. ,64，21-28)。该四糖在i^一异戊二烯基焦磷酸上预装配。大肠杆菌细胞被膜含有内衆膜即带有应力的(stress-bearing)肽聚糖层和由磷质 内单层和外单层组成的不对称外膜，这构成了细菌LPS。LPS含有脂质A锚形体、含有3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸的核心和0-抗原区三个组分(参见:Raetz, C. R. H.和Whitfield, C. (2002)Annu. Rev.Biochem. , 71, 635-700 ; Whitfield, C. (2006) Ann. Rev. Biochem. 75, 39-68 ; Samuel, G.和Reeves, P. R. (2003) Carbohydrate Research, 338，2503-2519;及其中关于细菌LPS 的 0_抗原装配综述的参考文献)。细菌LPS的0-抗原组分是大的、极度多变的多糖，可以是同聚的，由单一重复单糖组成，或者杂聚的，含有3-6个糖单元的10-30个重复(Reeves, P. R. , Hobbs, M. , Valvano, M.A.，Skurnik，M.，Whitfield, C.，Coplin，D.，Kidoj N.，Klena，J.，Maskell，D.，Raetz,C.R.H.和 Rick，P.D. (1996)Trends Microbiol.，4，495-503)。因此，0-抗原是细菌细胞表面的主要特征并构成毒力和致病性的重要决定因子(Law，D. (2000) J. App.Microbiol. , 88, 729-745; Spears, K. J. , Roe, A. J.和 Gaily, D.L. (2006) FEMS Microbiol.Lett.，255，187-202; Liu, B.，Knirel，Y. A.，Feng, L.，Perepelov, A. V.，Senchenkova, S.N.，Wang, Q.，Reeves, P. R.和 Wang，L (2008) FEMS Microbiol. Rev. 32，627-653 ; StenutZjR^WeintraubjA.和 Widmalm，G. (2006)FEMS Microbiol. Rev. 30，382-403) 已经鉴定出具有超过180个独立0-血清型(属于独特的0-抗原结构)的大肠杆菌菌株(Stenutz, R. , ffeintraub, A.和 Widmalm, G. (2006)FEMS Microbiol. Rev. 30, 382-403) 0-抗原重复单位在与i^一异戊二烯基焦磷酸连接的内膜细胞溶质面上进行预装配。脂质-连接的重复单位横向地扩散(翻转(flip-flop))到内膜的周质表面并在转运到外膜和连接到LPS之前聚合。大多数杂聚合0-抗原重复单位在还原末端或者具有N-乙酰基葡萄糖胺(“GlcNAc”)或者具有N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)。已假定通过被WecA催化的GIcNAc-P或GalNAc-P从其相应的糖核苷酸衍生物转移到十一异戊二烯基单磷酸(“Und-P”)上，启动脂质中间体的生物合成(Samuel, G.和 Reeves, P. R. (2003)Carbohydrate Research, 338, 2503-2519 ; Alexander, D. C.和 Valvano, M. A. (1994) J. Bacteriol. , 176, 7079-7084; Zhang, L. , Radziejewska-Lebrecht, J. , Krajewska-Pietrasik,D.,Tolvanen,P.和Skurkik1M. (1997)Mol. Microbiol. 23, 63-76;Amor, P. A.和 Whitfield, C. (1997)Mol.Microbiol. 26(145-161) ;ffang, L.和 Reeves, P. R. (1998) Infect. Immun. 66，3545-3551)。虽然已经表征了 WecA的GlcNAc-磷酸转移酶活性的性质和特异性(Rush，J. S.，Rick, P. D.和ffaechter, C. J. (1997) Glycobiology, 7，315-322)，但是 WecA 催化 GalNAc-P-P-Und 合成的结论是基于遗传学研究(Wang, L.和 Reeves, P. R. (1998) Infect. Immun. 66, 3545-3551)。这样的较早遗传学研究表明通过被WecA催化的GalNAc-P从UDP-GalNAc酶促转移到Und-P上启动脂质-连接的四糖中间体的生物合成(Wang, L.和Reeves, P. R. (1998) Infect.Immun. 66，3545-3551)。然而，没有直接的酶学证据证明WecA利用UDP-GalNAc作为GalNAc-P 供体。此外，先前已提出大肠杆菌055 gne和gnel基因编码UDP-GlcNAc 4_差向异构酶(Wang, L. , Huskic, S. , Cisterne, A. , Rothemund, D.和 Reeves, P. R. (2002) J. Bacteriol. 184，2620-2625; Guo, H. , Yi, ff. , Li, L.和 Wang, P. G. (2007) Biochem. Biophys. Res.Commun. , 356, 604-609)。先前的报导鉴定了分别来自大肠杆菌055 (Wang, L. , Huskic,S. , Cisterne, A. , Rothemund, D.和 Reeves, P. R. (2002) J. Bacteriol. 184, 2620-2625)和大肠杆菌 086(Guo，H.，Yi，W.，Li，L.和 Wang, P. G. (2007) Biochem. Biophys. Res.Commun. , 356, 604-609)的两个基因，分别为大肠杆菌055 gne和大肠杆菌086 gnel,它们与同一基因家族内的Z3206基因有100%同一性。因此，将会一直导致技术人员相信Z3206基因也编码UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc差向异构酶。 发明简述现在令人惊奇地发现，由大肠杆菌0157中的Z3206基因编码的差向异构酶能催化在十一异戊二烯基焦磷酸上合成N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)的反应，从而启动寡糖或多糖的形成。在一个方面，本发明涉及一种重组原核生物合成系统，其产生多糖的全部或一部分，包含在i^一异戊二烯基焦磷酸上合成GalNAc的差向异构酶。本发明进一步包括合成在还原末端具有GalNAc的多糖的全部或一部分的糖基转移酶，并且再进一步包括合成在还原末端具有GalNAc的抗原性多糖的全部或一部分的糖基转移酶。在另一个方面，本发明涉及在i^一异戊二烯基焦磷酸上产生GalNAc的差向异构酶，和在一个进一步方面，该差向异构酶由Z3206基因编码。在一个另外的方面，本发明涉及用于产生N-糖基化蛋白的表达系统，包含编码寡糖基转移酶的核苷酸序列；编码蛋白载体的核苷酸序列；来自至少一种细菌的至少一种寡糖或多糖基因簇；其中该多糖在还原末端含有GalNAc ;和编码差向异构酶的核酸序列。在一个再进一步方面，本发明涉及一种包含Z3206基因的重组原核生物合成系统，该Z3206基因编码将GlcNAc-P-P-Und转变成GalNAc-P-P-Und的差向异构酶。在又一个另外的方面，本发明涉及一种包含大肠杆菌055 gne基因或大肠杆菌086 gnel基因的重组原核生物合成系统，该基因编码将GlcNAc-P-P-Und转变成GalNAc-P-P-Und的差向异构酶。在再一个方面，本发明涉及一种N-糖基化蛋白，其包含至少一种引入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸，和在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的聚糖。在还另一个方面，本发明涉及一种生物缀合物疫苗，其包含具有至少一种引入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T的N-糖基化蛋白，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸；在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的免疫原性聚糖；和佐剂。在一个另外的方面，本发明涉及在宿主细胞中产生N-联糖基化蛋白的方法，该宿主细胞包含编码由在还原末端含有GalNAc的至少一种细菌装配至少一种寡糖或多糖的糖基转移酶的核酸；编码蛋白载体的核酸；编码寡糖基转移酶的核酸；和编码差向异构酶的核酸。在一个进一步方面，本发明涉及生物合成系统和蛋白质在制备生物缀合物疫苗中的应用。在一个另外的方面，本发明涉及用于产生单糖、寡糖和多糖的方法，和在一个再进一步方面，本发明涉及用于产生抗原性聚糖和N-糖基化蛋白的方法。附图简述图I显示由来自大肠杆菌0157的膜部分合成[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P_Und的时程。将来自大肠杆菌菌株0157的膜部分与UDP-[3H]GlcNAc—起于37°C孵育指定时间。按实施例2中描述的方法提取[3H]脂质产物并测定[3H]G1cNAc掺入到[3H]GlcNAc-P-P-Und(O)和[3H]GalNAc-P-P-UncK )中。 图2显示由GlcNAc-P-P-Und形成GalNAc-P-P-Und的提出的生物合成途径。图3显示由来自大肠杆菌菌株0157的膜部分合成[3H]GalNAc-P-P-Und的纯化和表征。将来自大肠杆菌0157的膜部分与UDP-[3H]GlcNAc —起孵育，并按实施例3中描述的方法纯化[3H]GalNAc脂质。图3A显示在硼酸盐浸溃的硅胶G (Quantum I)上经DEAE-纤维素纯化后[3H]HexNAc脂质的制备型薄层层析图。图3B显示从小图A中制备板中回收后在硼酸盐浸溃的硅胶G (Baker，Si250)上经纯化的[3H]GalNAC-P-P_Und的薄层层析图。图3C显示在图3B中纯化的[3H]GalNAc-P-P-Und经温和的酸水解后回收的[3H]-氨基糖的下行纸层析图(硼酸盐浸溃的瓦特曼I号纸(Whatman No. Ipaper))。图3D显示用NaBH4还原来自图3C的[3H]氨基糖产生的[3H] HexNAc-糖醇的下行纸层析图(Whatman No. 3MM)。图4显示大肠杆菌21546细胞和大肠杆菌21546细胞在用pMLBAD:Z3206转化后的代谢性标记。大肠杆菌21546(图4A)和大肠杆菌21546:pMLBAD/Z3206(图4B)用[3H]GlcNAc于37°C进行代谢性标记5分钟。按实施例3中描述的方法提取[3H]G1cNAc/GalNAc-P-P-Und，使其不含水溶性污染物后在硼酸盐浸溃的硅胶板(Baker Si250)上通过薄层层析进行分离。使用Bioscan层析扫描仪检测放射性脂质。GalNAc-P-P-Und和GlcNAc-P-P-Und的层析位置用箭头表示。图5显示由来自大肠杆菌菌株的膜部分与UDP-[3H]GlcNAc —起孵育形成的[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und的薄层层析图。将来自大肠杆菌菌株K12 (图5A)、0157 (图5B)、21546(图 5C)和 21546 :pMLBAD/Z3206(图 5D)的膜部分与 UDP-[3H] GlcNAc 一起于 37。。孵育10分钟，按实施例3中描述的方法提取[3H]脂质产物，通过分配使其不含水溶性污染物，然后在硼酸盐浸溃的硅胶板(Baker Si250)上通过薄层层析进行分离。GalNAc-P-P-Und和GlcNAc-P-P-Und的层析位置用箭头表示。图6显示GlcNAc-P与UMP孵育后的卸载(discharge)。将来自大肠杆菌21546:Z3206的膜部分与UDP_[3H]G1cNAc —起于37°C预孵育至将GlcNAc-P-P-Und酶标记10分钟(图6A)，然后与ImM UMP 一起进行第二个孵育期，包括或Imin (图6B)或2min(图6C)。在指定的孵育期后，按实施例3中描述的方法提取[3H]GlCNAC/GalNAC-P-P-Und，并在硼酸盐浸溃的娃胶板(Baker Si250)上通过薄层层析进行解析。GalNAc-P-P-Und和GlcNAc-P-P-Und的层析位置用箭头表示。
图I显示由来自表达Z3206的菌株21546的膜催化的外源[3H]GlcNAc-P-P_Und和[3H]GalNAc-P-P-Und转变成直接有关的[3H=HexNAc-P-P-Und产物。将来自大肠杆菌菌株21546(图7B和图7E)和21546:pMLBAD/Z3206 (图7C和图7F)的膜部分与纯化的[3H]GlcNAc-P-P-UncK 图 7A,图 7B 和图 7C)或[3H] GalNAc-P-P-Und (图 7D,图 7E 和图 7F 的分小图)(在1%曲通X-100 (Triton X-100)中超声处理进行分散)一起于37°C孵育I分钟。按实施例3中描述的方法提取[3H]GlCNAC/GalNAC-P-P-Und，在硼酸盐浸溃的硅胶板(BakerSi250)上通过薄层层析进行解析并用Bioscan AR2000放射性层析扫描仪进行检测。图8显示未糖基化和糖基化AcrA蛋白的SDS-PAGE分析。由携带AcrA表达质粒和与pMLBAD: Z3206 (第I泳道)、pMLBAD: gne (第2泳道)或载体对照pMLBAD (第3泳道)互补的Pgl操纵子A gne的大肠杆菌DH5 a细胞制备的周质提取物用10%SDS_PAGE分离后转移到硝化纤维素膜上。用抗AcrA抗血清检测AcrA及其糖基化形式。显示了对应于未糖基化(AcrA)和糖基化AcrA(gAcrA)的条带位置。图9显示已经由Liu B等人鉴定的基因(Liu B等人，Structure and geneticsof Shigella 0 antigens (志贺氏菌0抗原的结构和遗传学)FEMS MicrobiologyReview, 2008. 32:p. 27)。

图10是显示含有合成弗氏志贺氏菌6(S. flexneri 6) 0抗原所需基因的DNA区的方案。图11显示弗氏志贺氏菌6 0抗原在大肠杆菌中的表达。LPS通过银染色或者通过转移到硝化纤维素膜和通过抗弗氏志贺氏菌6的抗体检测予以显现。图12显示0抗原的HPLC。含有弗氏志贺氏菌-Z3206的大肠杆菌细胞(SCM3)、含有弗氏志贺氏菌+Z3206的大肠杆菌细胞(SCM3)或空大肠杆菌(SCM3)细胞的LLO分析。图13显示来自表达EPA、pglB和弗氏志贺氏菌60-抗原+/-Z3206的大肠杆菌细胞的经镍纯化的蛋白的蛋白质印迹图。发明详述本发明包括一种重组原核生物合成系统，其包含编码差向异构酶的核酸，该差向异构酶合成在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的寡糖或多糖和在聚糖的还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的N-糖基化蛋白。术语“部分氨基酸序列”也称为“最优化共有序列”或“共有序列”。最优化共有序列被寡糖基转移酶(“0ST，” “OTase”)进行N-糖基化，其效率比常规共有序列“N_X_S/T”
高得多。一般而言，术语“重组N-糖基化蛋白”是指在天然不包含所述蛋白编码核酸的宿主细胞中产生的任何多肽或寡肽。在本发明的正文中，该术语是指在原核宿主细胞例如埃希氏菌(Escherichia spp.)、弯曲杆菌(Campylobacter spp.)、沙门氏菌(Salmonellaspp.)、志贺氏菌(Shigella spp.)、螺杆菌(Helicobacter spp.)、假单胞菌(Pseudomonasspp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)中，和在进一步实施方案大肠杆菌(Escherichia coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等中重组产生的蛋白质，其中将所述蛋白编码核酸导入到所述宿主细胞中并且其中所编码的蛋白被OTase进行N-糖基化，所述转移酶天然存在于或者被重组地导入到所述宿主细胞中。 根据氨基酸的国际上接受的单字母代码，缩写词D、E、N、S和T分别表示天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸。根据本发明所述的蛋白质包含被引入到蛋白质并被N-糖基化的最优化共有序列D/E-X-N-Z-S/T中的一个或多个。因此，本发明的蛋白质不同于也含有该最优化共有序列但不包含任何额外的(引入的)最优化共有序列的天然存在的空肠弯曲杆菌N-糖蛋白。最优化共有序列的引入可以通过一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代来完成。可通过化学合成策略(例如固相辅助的化学肽合成)完成一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代以引入最优化共有序列，根据本发明，这项技术对于本领域技术人员来说是众所周知的。对于较大的多肽来说可选和优选的是，根据本发明，可通过作为本领域标准技术的重组技术来制备本发明的蛋白质。本发明的蛋白质具有它们可以以高效和在任何宿主中产生的优点。在本发明的一个实施方案中，宿主包含来自弯曲杆菌、例如来自空肠弯曲杆菌的功能性Pgl操纵 子。在进一步实施方案中，来自弯曲杆菌并用于实施本发明的寡糖基转移酶是来自大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)或海欧弯曲杆菌(Campylobacter lari)。根据本发明，寡糖基转移酶对于本领域技术人员来说是显而易见的。例如，寡糖基转移酶公开于诸如以下的参考文献中Szymanski, C. M.和 Wren, B. W. (2005) Protein glycosylationin bacterial mucosal pathogens (细菌粘膜病原体中的蛋白质糖基化)，Nat. Rev.Microbiol. 3:225-237。当所述原核宿主是弯曲杆菌，或者例如空肠弯曲杆菌时，功能性pgl操纵子可天然存在。然而，根据本领域之前所证明的及以上提及的，Pgl操纵子可以被转移到细胞中并在所述新的细胞环境中仍保留有功能。术语“来自弯曲杆菌、优选空肠弯曲杆菌的功能性pgl操纵子”意指编码弯曲杆菌、例如空肠弯曲杆菌的功能性寡糖基转移酶(OTase)和能够在脂质载体上装配寡糖的一个或多个特异性糖基转移酶的核酸簇，并且其中所述寡糖可以通过OTase从脂质载体转移到具有一个或多个最优化氨基酸序列D/E-X N-Z-S/T的靶蛋白上。应当理解，术语“来自弯曲杆菌、优选空肠弯曲杆菌的功能性Pgl操纵子”在本发明的正文中不一定就是指作为一个转录单位的操纵子。该术语只是要求在一个宿主细胞中重组蛋白N-糖基化的功能性组分存在。这些组分可以转录成为一个或多个独立的mRNA并且可以被一起或单独地调节。例如，该术语也包括位于一个宿主细胞中基因组DNA和质粒上的功能性组分。为了效率，在一个实施方案中，功能性Pgl操纵子的所有组分都可以被同时调节和表达。寡糖基转移酶，在有些实施方案中可来源于弯曲杆菌，而在其它实施方案中可来源于空肠弯曲杆菌。在另外的实施方案中，寡糖基转移酶可来源于本领域技术人员已知的具有寡糖基转移酶的其它生物体，例如沃林氏菌(Wolinella spp.)和真核生物。能够在脂质载体上装配寡糖的一个或多个特异性糖基转移酶可来源于宿主细胞或被重组地引入到所述宿主细胞中，唯一的功能性限制是由所述糖基转移酶装配的寡糖可以通过OTase从脂质载体转移到具有一个或多个最优化共有序列的靶蛋白上。因此，天然包含特异性糖基转移酶的宿主细胞的选择和/或替代所述宿主中天然存在的特异性糖基转移酶以及异源特异性糖基转移酶的引入都将能够使本领域技术人员去改变与本发明蛋白质中的最优化N-糖基化共有位点结合的N-聚糖。根据以上结果，本发明提供本发明蛋白质上N-聚糖模式的个体设计。因此，所述蛋白在它们的N-聚糖模式上可以是个性化的以满足生物学、药学和纯化的要求。
在本发明的实施方案中，所述蛋白可包含所述N-糖基化最优化氨基酸序列中的一个但也可不止一个，例如至少两个、至少3个或至少5个。本发明蛋白质中一个或多个N-糖基化最优化氨基酸序列的存在可具有增加其免疫原性、增加其稳定性、影响其生物活性、延长其生物半寿期和/或使其纯化简化的优点。最优化共有序列在位置X和Z上可包括除脯氨酸以外的任何氨基酸。术语“任何氨基酸”意指包括常用和稀有天然氨基酸以及合成氨基酸衍生物和类似物，它们都将仍然允许最优化共有序列被OTase进行N-糖基化。天然存在的常用和稀有氨基酸对于X和Z是优选的。X和Z可以相同或不同。需要注意的是，对于根据本发明所述的蛋白质中的每个最优化共有序列，X和Z可以是不同的。可以通过特异性糖基转移酶及其当在脂质载体上通过OTase进行转移来装配寡 糖时相互作用来决定与最优化共有序列结合的N-聚糖。根据本发明，本领域技术人员通过改变所需宿主细胞中存在的特异性糖基转移酶的类型和数量将能够设计出N-聚糖。本文所用的“单糖”是指一个糖残基。“寡糖和多糖”是指两个或更多个糖残基。本文所用的术语“聚糖”是指单糖、寡糖或多糖。“N-聚糖”在本文中定义为蛋白质中通过N-糖苷键与天冬酰胺残基的e-酰胺氮连接的可变组成的单糖、寡糖或多糖。在一个实施方案中，通过OTase转移的N-聚糖在革兰氏阴性或阳性细菌的细胞质膜中存在的十一异戊烯醇焦磷酸(“Und-P-P”)脂质-锚形体上进行装配。它们参与0抗原、0多糖和肽聚糖的合成(Bugg,T.D.和 Brandish, P. E. (1994). From peptidoglycan to glycoproteins: commonfeatures of lipid-linked oligosaccharide biosynthesis (从妝聚糖到糖蛋白月旨质连接的寡糖生物合成的共同特征).FEMS Microbiol Lett 119, 255-262;Valvano, M.A. (2003). Export of 0-specific lipopolysaccharide (0_ 特异性脂多糖的输出) FrontBiosci 8，s452-471)。进行了多项研究以决定脂质连接的重复四糖(4-N-乙酰基perosamine —岩藻糖一葡萄糖一GalNAc)的生物合成是否是通过WecA形成GalNAc-P-P-Und启动的。当来自大肠杆菌菌株K12、0157和PR4019 ( 一种WecA-过量表达菌株)的膜部分与UDP_[3H]GalNAc 一起孵育时，既未检测到[3H]GlcNAc-P-P-Und也未检测到[3H]GalNAc-P-P-Und的酶促合成。然而，当来自菌株0157的膜部分与UDP-[3H]GlcNAc—起孵育时，观察到两种酶标记的产物具有[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und的化学和层析特性，证实菌株0157含有能够使GlcNAc-P-P-Und和GalNAc-P-P-Und相互转变的差向异构酶。当外源[3H]GlcNAc-P-P-Und与来自菌株0157的膜一起孵育时，外源[3H]GlcNAc-P-P-Und被转变成[3H]GalNAc-P-P-Und也证实了差向异构酶的存在。当菌株0157用[3H]G1cNAc进行代谢性标记时，[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und两者都被检出。用Z3206基因转化大肠杆菌菌株21546能够使这些细胞在体内(in vivo)和体外(in vitro)合成GalNAc-P-P-Und。当来自菌株0157的膜与外源[3H]GalNAc-P-P-Und —起孵育时重新形成[3H]GlcNAc-P-P-Und，证明了差向异构酶反应的可逆性。在空肠弯曲杆菌N-糖基化系统在大肠杆菌中的表达中，Z3206不能代偿gne基因的损失，表明它没有作为UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc差向异构酶起作用。基于这些结果，证实了在大肠杆菌0157中，GalNAc-P-P-Und通过GlcNAc-P-P-Und差向异构酶可逆地合成后通过WecA形成GlcNAc-P-P-Und0对大肠杆菌0157 0-抗原亚基装配的起始反应进行研究证实GalNAc-P-P-Und合成是被有些先前未知的机制而不是被WecA催化的。本文给出的证据说明在大肠杆菌0157中，GalNAc-P-P-Und不是由WecA催化的GalNAc-P从UDP-GalNAc转移合成的，而是由Z3206基因编码的差向异构酶催化的GlcNAc-P-P-Und的4-0H可逆差向异构化合成的。因此，本发明包括用于装配重要的细菌细胞表面组分的一种新的生物合成途径以及用于合成GalNAc-P-P-Und的一种新的生物合成途径。本发明的一个进一步实施方案包括作为抗微生物剂新靶标的细菌差向异构酶。大肠杆菌0157合成具有重复四糖结构(4-N-乙酰基perosamine —岩藻糖一葡萄糖一GalNAc)的0-抗原。本文说明了脂质连接的四糖中间体的生物合成不是通过由WecA催化的GalNAc-P从UDP-GalNAc酶促转移到Und-P而启动的，这与较早的遗传学研究正好相反(Wang, L.和 Reeves, P. R. (1998) Infect. Immun. 66, 3545-3551)。本文描述的发明是通过同源性检索获得后再通过遗传学、酶学和代谢性标记实验的结果来验证的，证明WecA没 有利用UDP-GalNAc作为底物，而是需要WecA来合成GlcNAc-P-P-Und，然后通过菌株0157中Z3206基因编码的差向异构酶将其可逆地转变成GalNAc-P-P-Und。本发明的Z3206基因属于产生在其还原末端含有GalNAc残基的表面0_抗原重复单位的几个菌株中存在的基因家族(表I)。Z3206基因序列示于SEQ ID N0:1。先前的报导鉴定了分别来自大肠杆菌 055 (Wang, L. , Huskic, S. , Cisterne, A. , Rothemund, D.和Reeves, P. R. (2002) J. Bacteriol. 184，2620-2625)和大肠杆菌 086 (Guo, H.，Yi, ff.，Li, L.和 Wang, P. G. (2007)Biochem. Biophys. Res. Comm. , 356, 604-609)的两个基因即大肠杆菌055gne和大肠杆菌086 gnel，这两个基因与Z3206基因有100%同一性(表I)。大肠杆菌055gne基因序列显示为SEQ ID NO:3，而大肠杆菌086 gnel基因序列显示为SEQ ID N0:5。表IZ3206基因在表达在还原末端具有GalNAc的0_抗原链的细菌菌株中的相关性
权利要求
1.一种重组N-糖基化蛋白，其包含 引入的共有序列D/E - X - N - Z - S/T中的一个或多个，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸；和 在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的聚糖，其与至少所述一个或多个引入的共有序列通过N-糖苷键连接。
2.权利要求I的重组N-糖基化蛋白，其中所述蛋白是铜绿假单胞菌胞外蛋白。
3.权利要求I的重组N-糖基化蛋白，其中所述聚糖包含来自革兰氏阴性菌的寡糖或多糖。
4.权利要求3的重组N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌。
5.权利要求4的重组N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌6。
6.权利要求I的重组N-糖基化蛋白，其中所述聚糖包含寡糖或多糖，其包含以下结构
7.权利要求3的重组N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌。
8.权利要求7的重组N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌0157。
9.权利要求I的重组N-糖基化蛋白，其中所述聚糖包含寡糖或多糖，其包含结构a-D-PerNAc- a -L-Fuc-β -D-Glc- a -D-GalNAc0
10.一种生物缀合物疫苗，其包含权利要求I的重组N-糖基化蛋白和佐剂。
11.一种重组原核生物合成系统，其包含编码以下酶和蛋白的核酸 在i^一异戊二烯基焦磷酸上合成N-乙酰基半乳糖胺的差向异构酶； 在脂质载体上装配寡糖或多糖的糖基转移酶； 寡糖基转移酶；和 包含引入的共有序列D/E -X-N-Z- S/T中的一个或多个的蛋白，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸。
12.权利要求11的重组原核生物合成系统，其中编码差向异构酶的所述核酸包含SEQID NO. I。
13.权利要求11的重组原核生物合成系统，其中所述寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌。
14.权利要求11的重组原核生物合成系统，其中所述蛋白是铜绿假单胞菌胞外蛋白。
15.权利要求11的重组原核生物合成系统，其中所述寡糖或多糖是来自革兰氏阴性菌。
16.权利要求15的重组原核生物合成系统，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌。
17.权利要求16的重组原核生物合成系统，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌6。
18.权利要求11的重组原核生物合成系统，其中所述寡糖或多糖包含以下结构
19.权利要求15的重组原核生物合成系统，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌。
20.权利要求19的重组原核生物合成系统，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌 0157。
21.权利要求11的重组原核生物合成系统，其中所述寡糖或多糖包含结构a-D-PerNAC-a -L-Fuc-β -D-Glc- a -D-GalNAc0
22.—种产生N-联糖基化蛋白的方法，包括 a.)将编码i.) iv.)的核酸导入宿主生物中 i.)在i^一异戊二烯基焦磷酸上合成N-乙酰基半乳糖胺的差向异构酶； ii.)在脂质载体上装配寡糖或多糖的糖基转移酶； iii.)寡糖基转移酶；和 iv.)包含引入的共有序列D/E-X-N-Z- S/T中的一个或多个的蛋白质，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸；和 b.)培养所述宿主生物直到至少一种N-糖基化蛋白产生。
23.权利要求22的方法，其中编码差向异构酶的所述核酸包含SEQID NO. I。
24.权利要求22的方法，其中所述寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌。
25.权利要求22的方法，其中所述蛋白是铜绿假单胞菌胞外蛋白。
26.权利要求22的方法，其中所述寡糖或多糖是来自革兰氏阴性菌。
27.权利要求26的方法，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌。
28.权利要求27的方法，其中所述寡糖或多糖是来自弗氏志贺氏菌6。
29.权利要求22的方法，其中所述寡糖或多糖包含以下结构
30.权利要求26的方法，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌。
31.权利要求30的方法，其中所述寡糖或多糖是来自大肠杆菌0157。
32.权利要求22的方法，其中所述寡糖或多糖包含结构a-D-PerNAc- a -L-Fuc- β -D-Glc-a -D-GalNAc。
全文摘要
本发明涉及包含N-糖基化蛋白的生物缀合物疫苗。此外，本发明涉及一种重组原核生物合成系统，包含编码差向异构酶的核酸，该差向异构酶合成在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的寡糖或多糖。本发明还涉及含有在还原末端具有N-乙酰基半乳糖胺的寡糖或多糖的N-糖基化蛋白及用于产生这类N-糖基化蛋白的表达系统和方法。
文档编号C07K1/00GK102724997SQ201080061239
公开日2012年10月10日 申请日期2010年11月16日 优先权日2009年11月19日
发明者M·瓦克, 查尔斯·韦克特 申请人:格林考瓦因有限公司