专利名称：一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法
技术领域：
本发明一种当归多糖的硒化修饰方法，属于中药多糖的结构改造技术领域。
背景技术：
多糖广泛存在于植物、 微生物、藻类和动物体内，是构成生命的四大基本物质之一。随着化学和生物学的快速发展和分离技术的提高，多糖的生物学功能，特别是作为生命物质参与生命的全部时间和空间功能，突破了多糖作为支持组织和能量来源的传统观念，发现其具有更广泛的生物学功效，如增强免疫、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗突变、抗衰老、降血糖、降血脂等，而且具有毒性小、安全性高等优点。特别是多糖具有免疫增强、抗病毒等功能使得多糖物质成为人类及动植物医疗、保健、病虫害防治领域的重要成员，也是食品功能化学关注的焦点。近年来，多糖研究一直是国际前沿课题。研究证实，多糖的活性直接或间接地受到其结构的制约。影响多糖生物学活性的结构因素包括多糖的主链性质、支链性质和分子的高级结构，主链的糖单元组成和糖苷键类型直接决定多糖的活性，支链的类型、聚合度和在糖链上的分布及其取代度决定了多糖活性的大小，多糖分子的高级结构如链的柔韧性和空间构像与多糖的活性紧密相关。因此，可根据需要选择合适的分子修饰方法对多糖进行结构改造。利用糖残基上的羟基、羧基、氨基等基团进行化学修饰以引入新的基团，增强多糖的活性或使多糖产生新的活性。硒是生命必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的主要活性成分，可以直接或间接地清除体内氧自由基，抑制脂氧化或过氧化，阻断活性氧和自由基的致病作用，保护细胞免遭过氧化物的损伤，维护细胞膜的稳定性，对动物的生长、繁殖、免疫、抗感染、抗应激等方面起着重要的作用，但是我国约72%的地区属于低硒或缺硒地区，饲料和牧草硒含量小于0. 05mg/kg，不能满足动物的正常生理需要，补硒成为一种必要措施。硒的存在形式有无机硒和有机硒两种,常见的无机硒如亚硒酸钠和硒酸钠,有机硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒多糖是一种多糖有机硒化合物，具备了硒和多糖两者的活性，而且其生物活性普遍高于多糖和硒。补无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制；而有机硒的毒性低、副作用小，不但能够更好地发挥硒的作用，而且在促进生长和激发免疫反应上比无机硒显著，更易于为机体吸收和利用。然而天然硒多糖一般存在于植物或微生物中，含量较低，即使在高硒地区的植物或微生物中，硒多糖中的硒含量也相对较低。除了通过一些富硒手段(如人工协迫富硒栽培、富硒酵母培养等)使生物体中硒多糖的硒含量增加外，通过硒化修饰的方法获取硒多糖是重要手段。当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv. ) Diels的干燥根,其性温味甘、辛，归肝、心、脾经，具有补血养血、活血止痛、润燥通便等功效，主治血虚劳伤、血瘀疼痛、跌打损伤、痈肿疮疡、肠燥便秘、胎产诸病。现代药理学研究证实，当归多糖是当归的主要活性成分，具有增强免疫、抗病毒、降血糖、抗肿瘤、抗氧化等作用。本发明首次对当归多糖进行硒化修饰，建立了当归多糖的硒化修饰方法，基于产物的增强免疫活性优化了修饰条件，发现硒化修饰能显著提高当归多糖的增强免疫活性。
发明内容
技术问题本发明针对中药多糖生物活性低的问题，提供一种通过当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法，达到显著提高当归多糖的增强免疫活性的目的。技术方案
一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法，包括提取、纯化当归多糖，用硝酸-亚硒酸钠法对当归多糖进行硒化修饰，其特征在于，基于产物的增强免疫活性比较，确定最佳修饰条件为亚硒酸钠用量200mg(500mg当归多糖)，反应温度70°C，反应时间6h ；并筛选出一种活性最好的硒化当归多糖产品。有益效果I.建立了当归多糖的硒化修饰方法,通过正交实验优化了当归多糖的硒化修饰条件。2.证明硒化修饰能够显著提高当归多糖的增强免疫活性，并筛选出一种增强免疫活性最好的硒化当归多糖。与现有技术相比，本发明优点如下I.当归多糖的硒化修饰国内外未见报道，本发明提供了一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法及其优化的修饰条件，填补了国内外研究的空白。2.通过本发明的实施，证明硒化修饰能够显著提高当归多糖的增强免疫活性，并筛选出一种活性最好的硒化当归多糖，为研制新型免疫增强剂提供了材料和示范。
具体实施例方式I.当归多糖的提取用水煎-醇沉法。取当归饮片lOOOg，粉碎成O. 3 Icm3的小块，加95%乙醇2000mL浸泡12h，80°C水浴回流2次，每次lh，药物晾12h，加20倍量水煎煮2次，每次30min,合并滤液,浓缩至IOOOmL, 2500rpm离心20min,弃去沉淀,加95%乙醇使醇含量达90%，4°C静置12h，回收乙醇，离心，沉淀60°C真空干燥，得到粗的当归多糖。2.当归多糖的纯化将粗当归多糖用Sevage法去蛋白，真空干燥,加蒸懼水溶解成50mg mL—1的溶液，上Sephadex G-200 (2cmX 100cm)柱,用蒸懼水洗脱,流速12mL · IT1,自动收集器收集洗脱液，每管4mL，苯酚-硫酸法检测各管是否含糖，绘制洗脱曲线(得到I个峰)。合并含糖管洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的当归多糖(CAP)，用苯酚-硫酸法测定糖含量为92. 7%。3.当归多糖的硒化修饰用硝酸-亚硒酸钠法。(I)修饰条件设计由于亚硒酸钠用量、反应温度、反应时间是影响多糖硒化修饰的主要因素，在预实验的基础上，以亚硒酸钠用量(每500mg多糖)(A)、反应温度(B)和反应时间(C)为因素，按3因素3水平的L9 (34)正交试验设计9种修饰条件(表I)。表IL9 (34)正交试验设计因素水平表
权利要求
1.一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法，包括提取、纯化当归多糖，用硝酸-亚硒酸钠法进行硒化修饰，其特征在于，修饰条件为亚硒酸钠用量200mg (500mg当归多糖)，反应温度70°C，反应时间6h。
2.权利要求I所述方法获得的硒化当归多糖的增强免疫活性最高，较未修饰的当归多糖活性显著提高。
全文摘要
本发明为一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法，属于中药多糖的结构改造技术领域。提取、纯化当归多糖，用硝酸-亚硒酸钠法进行硒化修饰，以产物的增强免疫活性为指标，用L9(34)正交实验对亚硒酸钠用量、反应温度和反应时间3因素进行优选，确定最佳修饰条件为亚硒酸钠用量200mg(500mg当归多糖)，反应温度70℃，反应时间6h。本发明能显著提高当归多糖的增强免疫活性。
文档编号C08B37/00GK102718882SQ20121022604
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者刘家国, 姚万玲, 王德云, 秦韬, 胡元亮 申请人:南京农业大学