一种具有免疫活性双孢蘑菇多糖制备方法及用途
【专利摘要】一种具有免疫活性的双孢蘑菇多糖，由核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡糖糖、半乳糖组成的杂多糖，摩尔质量比=2.08:4.61:2.45:22.25:36.45:89.22:1.55，由双孢蘑菇经水浴，提取物用乙醇醇沉，对醇沉物进行脱蛋白处理，所得粗多糖用阴离子交换填料进行离子交换柱层析，采用蒸馏水洗脱，冷冻干燥，再经凝胶凝胶层析，用蒸馏水洗脱，冷冻干燥制得。该多糖具有免疫促进作用，可作为肿瘤等免疫功能低下疾病的辅助治疗药物或作为具有提高免疫力作用的功能性保健品和食品。
【专利说明】一种具有免疫活性双孢蘑菇多糖制备方法及用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种免疫活性多糖，具体地说，就是涉及一类具有免疫活性的双孢蘑菇多糖及其制备方法和应用。
技术背景
[0002]双孢蘑菇性平、味甘，能补脾益气，能增强人体抗病能力，具有长久的食用史。是目前世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌。也是我国食用菌出口创汇最多的产品。据中国食用菌协会统计，2009年我国双孢蘑菇产量达到2000万吨，主要以蘑菇罐头、蘑菇干片、盐水蘑菇等加工产品出口。从蘑菇中可提取一种多糖类物质(PS-K)，其具有抵抗人体病毒及抗癌作用，能增强小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬功能，并随着剂量的增高，胸腺指数、脾指数也有增高的趋势，能增强机体的免疫功能。但目前双于包蘑菇中的多糖成分及其抗肿瘤免疫调节机制仍未完全清楚。
[0003]双孢蘑菇的保健功效已被悠久的食用史所证实，但是其活性来源、活性与结构的关系却进展缓慢。大量国内外的研究表明，双孢蘑菇中多糖类物质具有显著的生物活性，成为新药开发的突破点。然而多糖的结构多样性、复杂性使其结构鉴定、构象分析以及构效关系等方面的研究远远落后于同样为大分子物质的蛋白质和核酸，因此开展对双孢蘑菇多糖的研究，具有科研和现实意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就在于提供一种具有免疫活性的双孢蘑菇多糖、制备方法及用途。
[0005]为实现所述目的，本发明采用下述技术方案:一种具有免疫活性的双孢蘑菇多糖，由包括以下步骤的方法制得:
(1)将新鲜双孢蘑菇30-70°C下烘干、粉碎；
(2)水浴法提取l_4h，液料比 20mL: 19_50mL:1/ g、温度 50 -90°C ；
(3)用乙醇对水浴提取物进行醇沉，料液与乙醇的重量比为100: 9- 20 ；
(4)采用Sevag法对醇沉物进行脱蛋白处理3-7次，干燥得到粗多糖；
(5)粗多糖用阴离子交换填料进行离子交换柱层析，采用蒸馏水洗脱，冷冻干燥得到多糖ABPI ；
(6)多糖ABPI用凝胶填料用蒸馏水洗脱，冷冻干燥，得到双孢蘑菇多糖ABP1，乙醇的体积分数为65%- 85%。
[0006]步骤(5)中，离子交换剂为D201、DEAE-52和CM52其中的一种。
[0007]步骤(6)中，凝胶剂为Sephadex G-200、Sephadex G-100、Bio_Gel-p-2 ,Bio-Ge1-p-4 > sepharose 2B > sepharose 4B > sephacryl SlOO 和 sephacryl S300其中的一种。
[0008]上述方法所的双孢蘑菇多糖ABPla经HPGPC凝胶排阻色谱和萄聚糖凝胶电泳测得其分子量范围在1000k Da 1100k Da内；经GC-MS测得ABPla糖基组成由核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡糖糖、半乳糖组成的杂多糖，摩尔质量比为2.08:
4.61: 2.45: 22.25: 36.45: 89.22: 1.55。高碘酸氧化可以推断ABP Ia的糖苷键结构。ABP Ia具有I — 2，1 — 4位点的糖苷键结构，可能具有I — 3位点的糖苷键结构，而几乎不具有I — 6位点的糖苷键结构。IR红外光谱表明ABP Ia具备了糖类化合物所应有的分子间和分子内的氢键和C-H伸缩振动峰、C-H的变角振动峰，可以初步判断这些组分均为糖类化合物，是α型多糖。AFM扫描可以看出ABP Ia在5%时聚集成近似棒状的螺旋结构，每个棒状螺旋由多股糖链缠绕而成，且糖链可能具有较多分支，说明多糖的水溶液浓度会影响糖链的聚集程度，ABP Ia在5%水溶液的状态下，糖链结构松散，以单糖链为单位自然分散，弯曲起伏，多糖链因糖苷键的结合方式差异，产生L型或D型的立体构型，可能导致糖链的支链延伸方向不同，从而造成糖链的弯曲转折。
[0009]本发明所得双孢蘑菇多糖具有免疫促进作用，可用于制备抗肿瘤药，也可也用于提闻免疫功能的食品和保健品。
[0010]
【具体实施方式】
[0011]实施例1
双孢蘑菇多糖的制备:
(a)准备双孢蘑菇lOOOg，于45°C下烘干、粉碎，加3000g蒸馏水，于75 °C水浴提取，过滤，真空浓缩；
(b)80 %乙醇醇沉,离心(4500r , 15min)弃上清；
(e)Segva法脱蛋白6次；
(f)选用离子交换填料(D201、DEAE-52、CM52)进行离子交换柱层析得ABPI；
(g)选用凝胶柱填料(SephadexG-200、Bi o~Ge 1-p-4、sepharose 4B、sephacrylSlOO、sephacryl S300)进行凝胶柱层析得到1000mg的多糖ABPla多糖结构分析方法:
(1)用高压凝胶排阻色谱法(HPGPC)测定双孢蘑菇多糖ABPla的分子量范围；
(2)采用高碘酸氧化法对糖苷键结构进行分析；
(3)GC-MS对多糖的单糖组成及其比例进行分析；
(4)红外光谱反映多糖的结构基团；
(5)通过原子力显微镜成像扫描，观察多糖的立体形貌，进一步描述ABP的微观立体结构。
[0012]多糖的免疫活性检测方法
(I)材料
多糖:经上述方法制备所得双孢蘑菇多糖ABPI
对照:自购香菇多糖，灵芝多糖，茯苓多糖，5-氟尿嘧啶Bale小鼠:雄性，22g，购于南方医科大学SPF级实验动物中心`
培养基:89%完全培养液RPMI 1640,10 %小牛血清，1%终浓度分别为为100U/mL和100 μ g/mL的双抗存液(青霉素+链霉素)。
[0013]MTT溶液:浓度为5mg/mL，用Hank’ s缓冲液配制。
[0014]免疫调节细胞模型原代培养小鼠脾脏细胞的刀豆蛋白(Con A)增殖模型:以T细胞丝裂原伴刀豆蛋白(ConA)模拟抗原信号剌激小鼠全皮细胞，诱导T淋巴细胞的增殖。
[0015]原代培养小鼠脾脏细胞的脂多糖(LPS)增殖模型:以B细胞丝裂原脂多糖(LPS)模拟抗原信号剌激小鼠全皮细胞，诱导B淋巴细胞的增殖。
[0016]计算公式:f.cpm 二(实验组空白对照组)/(阴性对照组空白对照组)
(3)脾细胞悬液配制:
小鼠脱颈处死，乙醇浴后于超净台无菌开腹。用手术剪小心取出脾脏，用Hank’ s液悬空清洗。脾脏放入盛有Hank’s液的培养皿中清洗，除血剪碎。用Hank’s液转移至100目细胞筛，用一次性注射器芯挤压研磨，用Hank’s液洗入离心管，制成悬液。1000r/min离心5min，弃去上洁。取经0.22 μ m滤器过滤的超纯水3mL吹进离心管裂解红细胞，吹匀，静止30min后快速加入经0.22 μ m滤器过滤的1.8% NaCl溶液3mL, 3000r /min离心8min ,弃去上清。Hank’s液清洗，1000r/min离心5min ,弃上清。计数后，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基制成12 X IO6个/mL细胞悬液。
[0017](4)接种培养
取96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液50 μ L，于37°C、5% CO2培养箱中培养4h。取出细胞培养板，每孔加样品25 μ L，空白对照组为加培养基25 μ L。加入用无菌培养基配制的200 μ g/mL的ConA (LPS) 25 μ L，使其终浓度为5 μ g/mL,阴性对照组为不加ConA而加培养基25 μ L。每个浓度样品设4复孔，设50 μ g/mL和1000 μ g/mL两个浓度梯度，分别培养24h和48h。
·[0018](5) MTT活性检测
每孔加MTT溶液20ul。继续孵育也后终止培育。每孔加150ul DMSO，振荡IOmin，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以培养时间、样品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制免疫调节效果图表。
【权利要求】
1.一种具有免疫活性的双孢蘑菇多糖，其特征在于，由包括以下步骤的方法制得:(I)将新鲜双孢蘑菇下烘干、粉碎；(2)水浴法温度90°C ；(3)用乙醇对水浴提取物进行醇沉，乙醇在混合液中的体积分数为10% ; (4)采用Sevag法对醇沉物进行脱蛋白处理6次，干燥得到粗多糖；(5)粗多糖用阴离子交换填料进行离子交换柱层析，采用蒸馏水洗脱，冷冻干燥得到多糖ABPI ; (6)多糖ABPI用凝胶填料用蒸馏水洗脱，冷冻干燥，得到双孢蘑菇多糖ABPIa。
2.根据权利要求1所述的具有免疫活性的双孢蘑菇多糖，其特征在于，为由核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡糖糖、半乳糖组成的杂多糖，摩尔质量比=2.08: 4.61:2.45: 22.25: 36.45: 89.22: 1.550。
3.—种如权利要求所述的双孢蘑菇多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (I)将新鲜双孢蘑菇70°C下烘干、粉碎；(2)水浴法温度90°C ； (3)用乙醇对水浴提取物进行醇，乙醇在混合液中的体积分数为45% ； (4)采用Sevag法对醇沉物进行脱蛋白处理7次，干燥得到粗多糖；(5)粗多糖用阴离子交换填料进行离子交换柱层析，采用蒸馏水洗脱，冷冻干燥得到多糖ABPI ; (6)多糖ABPI用凝胶填料用蒸馏水洗脱，冷冻干燥，得到双孢蘑菇多糖ABPIa。
4.根据权利要求3所述的双孢蘑菇多糖的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，离子交换剂为D20UDEAE-52和CM52其中的一种。
5.根据权利要求3所述的双孢蘑菇多糖的制备方法，其特征在于步骤(6)中，凝胶剂为 Sephadex G-200、Sephadex G-100、Bio-Gel-p-2、Bio-Ge1-p-4、sepharose 2B、sepharose 4B> sephacryl SlOO 和 sephacryl S300 其中的一种。
6.根据权利要求1所述·的双孢蘑菇多糖在制备抗肿瘤药物、提高免疫功能的食品和保健品中的用途。
【文档编号】C08B37/00GK103588891SQ201310581357
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】不公告发明人 申请人:青岛农业大学