，月旨 多糖和CpG寡核苷酸、维生素D3、分枝杆菌抗原和来自寄生虫(如血吸虫或丝虫）的分子，例 如，胱抑素或ES-62。
[0108] 本发明也提供由以下独立包装组成的套件(试剂盒） a)根据本发明的药物制剂，其包含根据本发明的低过敏性的变体、DNA分子或重组表 达载体的有效量 b) 药物制剂，其包含其它药学活性物质和/或作用增强剂的有效量。
[0109] 该套件包含合适的容器，如盒子或纸箱、单独的瓶、袋或安瓿。该套件可包含例如 独立的安瓿，在所述安瓿中根据本发明的配剂各以溶解形式或以冻干形式存在，所述配剂 包含根据本发明的低过敏性的变体、DNA分子或重组表达载体和其它药物活性物质的配剂 的有效量。
[0110] 甚至没有进一步的实施方式也被认为，本领域技术人员能够在最宽范围内利用上 面的说明。因此，优选的实施方式仅仅被视为说明性公开，但绝不应理解为以任何方式来限 制的公开。
[0111] 因此，下列实施例应当解释本发明，而非对其进行限制。除非另有说明，百分比数 据是指重量百分比。所有温度都是摄氏度表示。"常规后处理":如有必要，加水，如有必要， 根据最终产物的构成，将pH值调整至2-10之间。
[0112] 通过生物技术方法制备并表征以下的根据本发明的低过敏性变体。然而，所述物 质的制备和表征也可以用本领域技术人员已知的其他方法实施。例如，也可以化学合成本 发明的低过敏性变体。本发明同样提供下面所述的根据本发明的低过敏性变体。
[0113] 实施例1 :在一个单个的环区域中具有脯氨酸缺失的Phlp6的变体 如下所述制备变体rPhlp6d[P29,30] + 6His、rPhlp6d[P57] + 6His和rPhlp6d[P79] + 6His并对其进行免疫学表征。类似地，制备并检测重组的未改变的过敏原（rPhl p6wt+ 6His)，且类似地，也可以制备并检测其它的根据本发明的禾本科的第6组过敏原 的低过敏性变体及其野生型蛋白质，尤其是Poap6。
[0114] 基因工程的构建： 通过长的重叠的DNA寡核苷酸的结合以及通过PCR标准方法的DNA扩增合成编码变体 的DNA。如此选择密码子，然后通过RI检测器确定颗粒的浓度，用MALS检测器记录颗粒的 光散射（Wen等，1996，Anal.Biochem. 240:155-166)。由这些数据以约5%的精确度计算 洗脱颗粒的平均质量。可以通过SEC/MALS/RI证实单体、二聚体、其它多聚体和聚集物。
[0115] 在SEC/MALS/RI分析中，变得清晰的是，分别在各个峰中洗脱的蛋白质在天然条 件下作为纯单体存在（图8,表1)。
[0116] 表I:Phlp6野生型和在环1、2、3或4中具有脯氨酸缺失的Phlp6变体的分 子量
1基于具有起始甲硫氨酸的氨基酸序列估算的分子量(软件：EditSeq6.0;DNA-Star Inc.，Madison，USA)〇 2通过凝胶过滤（SEC)测定粒子质量。给出的是在标定的峰窗口中洗脱的蛋白颗粒的 平均质量。
[0117] 使用折射率检测器（RI)OptilabrEX(Wyatt，SantaBarbara，USA)用于蛋白质浓度 的在线测定。用多角度检测器MiniDAWNTreos(Wyatt)测定颗粒的光散射。用软件ASTRA 5. 3. 2. 17 (Wyatt)通过具有0. 180ml/g的假设折光指数增量的Debeye形式进行颗粒质量 的计算。SEC柱：Superdex200GL10/ 300(GEHealthcare，Uppsala，瑞典）。洗脱液： 含有150mM氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液，pH7. 2。
[0118] 推导的氨基酸序列基于成熟的Phlp6.0102 (图3,图4)。通过在PCR反应中使 用缺乏相应的脯氨酸密码子的特异性寡核苷酸引入脯氨酸缺失的突变。如此选择这些寡核 苷酸，使得推导的蛋白质在5'末端携带一个六-组氨酸-融合部分（图5,图6)。
[0119] 通过拓扑异构酶反应将这些DNA片段连接在表达载体pTrcHis2Topo (Invitrogen，Carlsbad，USA)中。通过测序验证DNA的正确性。
[0120] 表达和纯化： 在大肠杆菌（fecAericAiacoJi)(菌株ToplO;Invitrogen)中进行重组组氨酸融合 蛋白的表达。通过N-末端组氨酸残基与Ni2+螯合基质（固定化金属离子亲和色谱，IMAC; 材料：HiTrap，GEHealthcare，Uppsala，瑞典）的特异性结合首先纯化rPhlp6wt+ 6 His和变体。随后浓缩得自IMAC洗脱物的重组蛋白，并进行凝胶过滤(材料=Superdex75; GEHealthcare)。
[0121] 生化分析： 首先通过SDS-PAGE及随后的考马斯染色检查制备的蛋白质的纯度。该分析显示了所 有蛋白质的非常高的纯度（图7)。
[0122] 分析凝胶过滤（SEC)允许根据蛋白质种类特定的水动力学半径分离蛋白质种类。 通过将折射仪（RI检测器)和多角度光散射检测器(MALS探测器)偶联至色谱系统可以实现 分子量的在线测定（SEC/MALS/RI方法）。在该方法中，给定测定时间。
[0123] 也通过UV-Vis光谱检查不溶性蛋白质团聚物的缺乏(光度计：Ultrospec 5300pro UV/VIS; GE Healthcare)。
[0124] 在UV-Vis光谱中，在240-800nm波长范围内记录蛋白质溶液的波谱。蛋白质溶 液中的不溶性团聚物吸收>300nm范围的波长，而高可溶性的蛋白质在此范围不吸收。该 波谱对于具有高溶解度的蛋白质是典型的。因此，根据本发明的蛋白质在天然条件下是可 溶的、高纯度的和单体。
[0125] 降低的IgE结合力的证据： 用于确定过敏症患者血清的特异性IgE的反应性的简单测试方法是条带检测。用这种 方法，可以同时检测较大数量的过敏症患者血清。
[0126] 为此，将测试物质以相同的浓度和量在非变性条件下彼此相邻地结合于硝酸纤维 素膜条带上。可以将一系列这样的膜条带同时与不同的过敏症患者血清进行温育。洗涤步 骤后，通过抗人IgE/碱性磷酸酶偶联物促进的颜色反应使特异性结合的IgE抗体在膜上 变得可见。
[0127] 分别使用18份草花粉过敏症患者血清与Phlp6变体的结果显示在图9中。作 为重要的对照，首先检测有和没有组氨酸融合部分的重组过敏原的IgE结合力。两种蛋白 质都表现出相同的IgE结合能力。因此，用于研究的N-末端组氨酸融合部分不干扰IgE与 Phlp6的结合。
[0128] 如未修饰的过敏原一般，突变体rPhlp6d[P101] + 6His与所有被测试的血清 均表现出相似良好的IgE结合力（图9)。由此得出，脯氨酸101的缺失对Phlp6的IgE结合能力没有显著影响。突变体rPhlp6d[P29,30] + 6His、rPhlp6d[P57] + 6His 和rPhlp6d[P79] + 6His的IgE结合力在不同的草花粉过敏症患者的血清中差别非常 显著。这是由各过敏症患者的IgE群体组成的IgE抗体的亲和力和表位特异性的变化而产 生。相比于未修饰的:rPhlp6wt+ 6His，突变体rPhlp6d[P57] + 6His和rPhlp6 d[P79] + 6His显示出与大部分血清明显降低的IgE反应性。然而，最低的IgE结合力通常 在突变体rPhlp6d[P29,30] + 6His的情况下观察到（图9)。
[0129] 用EAST抑制测试(酶变应原吸附剂测试（EnzymeAllergosorbentTest))进行溶 解的测试物质的IgE结合能力的检测。在该方法中，可以在溶液中研究过敏原/IgE的相互 作用，以此能排除例如由于固定于膜上导致的测试物质的表位的干扰屏蔽。
[0130] 如下进行EAST抑制测试。用过敏原，此处为rPhlp6wt+ 6His涂覆微滴定板。 通过洗涤去除未结合的过敏原分子后，用牛血清白蛋白封闭该板以防止以后的非特异性结 合。将过敏症患者的IgE抗体作为适当稀释的单独的血清用经过敏原涂覆的微滴定板温 育。经由抗hIgG/碱性磷酸酶偶联物通过底物的反应产生显色的最终产物以光度计定量过 敏原结合的IgE抗体的量。
[0131] 取决于浓度，通过可溶性过敏原或待测试的底物(重组的修饰的过敏原）使IgE抗 体的结合底物特异性地被抑制。
[0132] 在图10中所示的与Phlp6的重组过敏原变体的IgE抑制试验结果显示，由脯氨 酸残基P[29, 30]、P57和P79的缺失导致了Phlp6的IgE结合能力的降低。在这种情况 中，突变体d[P29, 30]的IgE结合能力显著低于d[P57]或d[P79]的IgE结合能力。较低 的抑制作用表明IgE表位的损失。突变体d[P101]显示用草花粉过敏症患者P32的血清没 有改变IgE结合力，和用血清P82仅很少地改变了结合力，这再次与野生型在高浓度的情况 接近。
[0133] 功能性致敏性降低的证明： 随后在体外检测在效应细胞的膜结合的IgE交联时突变体的功能作用及其激活。
[0134] 将草花粉过敏症患者的肝素化的全血与不同浓度的测试物质温育用于嗜碱性粒 细胞活化试验。这里，致敏物质能够结合特异性IgE抗体，所述抗体结合了高亲和力的嗜碱 性粒细胞的IgE受体。通过过敏原分子触发的IgE/受体复合物的交联导致信号转导，这导 致效应细胞的脱颗粒化并因此触发体内的过敏反应。
[0135] 可以通过用IgE受体交联偶联的表面蛋白（⑶203c)的信号转导表达的定量化证 明嗜碱性免疫细胞的过敏原诱导的活化（Kahlert等，ClinicalImmunologyandAllergy inMedicineProceedingsoftheEAACI2002 (2003)Naples，意大利 739-744)。通过焚 光标记的单克隆抗体与表面蛋白的结合以及随后的通过荧光激活的流式细胞仪的分析高 度灵敏地测定在细胞上表达的表面蛋白的数量和细胞池的活化细胞的百分比值。
[0136] 在本实施例中，本测试中采用的粒细胞由过敏症患者P21的全血中分离。该过敏 症患者代表在条带试验方法中其IgE抗体表现出与rPhlp6d[P29,30] + 6His的可检测 的结合的这样的过敏症患者(组"A")。
[0137] 在未修饰的重组过敏原和rPhlp6d[P29,30]+ 6His的浓度相同时，在两个供体 的情况下后者表现出对与膜结合的IgE抗体更低的结合力并因此导致嗜碱性粒细胞的活 化急剧降低（图11)。
[0138] 因此该结果验证了突变体rPhlp 6d[P29, 30] + 6His的功能性降低的致敏性。 在供体P21的情况下，突变体rPhlp 6d[P57] + 6His和rPhlp 6d[P79] + 6His清楚 显示出嗜碱性细胞活化的降低。因此用该测试可以验证，至少在部分过敏症患者中，在Phl P6的这两个区域中脯氨酸突变也降低了IgE结合能力。
[0139] 变体的T细胞反应性： 为了检测T细胞的反应性，在未修饰的过敏原刺激下根据常规方法建立草花粉过敏症 患者的寡克隆的T细胞系。在增殖试验中，将不同的T细胞系用参照过敏原rPhlp 6wt 以及修饰的重组过敏原变体刺激。通过[3H]胸腺嘧啶的嵌入用常规方法测定增殖率。
[0140] 变体rPhlp6d[P29, 30] + 6His、rPhlp6d[P57] + 6His和rPhlp6d[P79] + 6His刺激被研究的T细胞系以与由未修饰的过敏